金银花绿原酸的酶解工艺及抗氧化活性研究

石奇

(西安文理学院 化学工程学院，陕西 西安 710065)

金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花［1］。古人将其列为上品，素有“久服轻身”的说法，现代研究表明其具有抗氧化［2］、抗肿瘤［3］、抑菌［4］等功效。绿原酸是植物细胞在有氧呼吸过程中经磷酸戊糖途径的中间产物合成的一种苯丙素类物质［5］，绿原酸作为金银花的主要活性成分之一［6-7］，曾引起学者的广泛关注［8-9］。但目前提取过程主要存在提取时间过长，提取温度较高，金银花绿原酸活性降低等问题。酶解法提取植物中有效成分具有快速、高效、反应时间短、条件温和等诸多优点［10-11］。

羟基自由基(OH·)是一种能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜和多糖化合物的活性氧［12］。衰老的自由基学说认为，超氧阴离子自由基(O2－·)是生物代谢过程中产生的高毒活性氧［13］。油脂过氧化值(POV)是油脂及其制品酸败程度的标志，POV值越大，说明酸败程度越高［14］。

本研究采用纤维素酶对金银花绿原酸提取工艺进行优化，以维C 为对照，评价其对OH·、O2－·以及油脂的抗氧化活性，以期为金银花绿原酸在食品和医药方面的应用研究提供理论依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

金银花(产自河北省邢台市);纤维素酶(酶活力≥400 U/mg);绿原酸标准品(纯度≥98%);猪油;无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、三羟甲基氨基甲烷、邻二氮菲、硫酸亚铁、硫代硫酸钠、三氯甲烷、碘化钾、邻苯三酚、乙酸乙酯、双氧水、无水碳酸钠、冰乙酸均为分析纯;乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯。

RE-52AA 型旋转蒸发仪;LXJ-64-01 型离心机;TV-180 紫外-可见分光光度计;FZ102 型粉碎机;DF-101S 恒温水浴锅;AGILENTLC 12 型高效液相色谱仪。

1.2 金银花绿原酸提取工艺

取100.00 g 金银花干燥粉末，加入纤维素酶，在乙醇水溶液中定温提取，离心分离，得金银花滤渣。再次提取，合并2 次提取液，减压浓缩，在冰浴中对液体进行灭酶活处理，用乙酸乙酯纯化处理［15］，低温真空干燥，得金银花绿原酸。

1.3 金银花绿原酸含量测定

采用高效液相色谱法测定金银花中绿原酸［16］。色谱柱为C18 粒(250 nm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈∶0.4%磷酸(15∶85)，超声处理15 min，流速1 mL/min，检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL，样品在进样前经0.45 μm 滤膜过滤。

精密称取绿原酸对照品0.010 6 g，加50%甲醇溶解，并稀释至50.0 mL，即为对照品溶液。分别吸取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL 置棕色量瓶中，加50% 甲醇稀释至10.0 mL，摇匀，按上述色谱条件，以峰面积积分值为纵坐标，浓度为横坐标，得绿原酸标准工作曲线y =5.322 1x +0.581 9，相关系数为R2=0.999 6。

1.4 抗氧化活性测定

1.4.1 羟基自由基OH·的清除能力测定 OH·体系的产生［17］，根据实验过程略作修改。吸取0.75 mmol/L的邻二氮菲无水乙醇溶液1.0 mL，依次加入pH=7.4 磷酸盐缓冲液2 mL，0.75 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL，蒸馏水2.0 mL，反应液35 ℃水浴保温1.5 h，参比溶液用蒸馏水代替FeSO4溶液，于536 nm 处测定吸光度A0。在上述条件下，蒸馏水减少1 mL，相应加入1 mL 0.01% H2O2溶液，测定吸光度A1。

对OH·的清除能力进行测定:按上述步骤，在加H2O2前，以配制好的不同浓度的绿原酸溶液或维C 溶液代替1.0 mL 蒸馏水，测定其吸光度Ax。

1.4.2 超氧阴离子自由基O2－·清除能力测定采用邻苯三酚自氧化法［17］，根据实验过程略作修改。分别吸取 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲溶液2.5 mL，蒸馏 水3. 2 mL，在25 ℃水 浴 中保 温20 min，取出加入25 ℃预热过的3 mmol/L 邻苯三酚0.3 mL，迅速摇匀后，在325 nm 下每隔5 min 测吸光度。参比溶液以0.01 mol/ L HCl 替代邻苯三酚，计算吸光度随时间的变化率C0。

对O2－·的清除能力进行测定:依上所述，在加入邻苯三酚前，加入配制好的不同浓度的绿原酸溶液或维C 溶液1.0 mL，蒸馏水相应的减少1.0 mL，在波长为325 nm 下间隔5 min 测其吸光度。计算吸光度随时间的变化率Cx。

1.4.3 绿原酸对猪油的抗氧化能力测定

1.4.3.1 供试样品的制备 称取金银花绿原酸24 mg，溶于1 mL 乙醇中，加入20 g 猪油中，充分搅拌溶解，配成含氧化剂1.2 mg/g 的母液。根据实验再配制出不同浓度的待测液。

1.4.3.2 油脂过氧化值测定过程［18］称取2.00 ～3.00 g 混匀的试样，加30 mL 三氯甲烷-冰乙酸混合液。加入饱和碘化钾溶液1.00 mL，振摇后避光放置3 min。加100 mL 水，摇匀，用0. 01 mol/L NaS2O3标准滴定溶液滴定至蓝色消失为终点，消耗NaS2O3溶液体积为V1，空白实验消耗NaS2O3溶液体积为V0。

式中，c 为NaS2O3溶液的物质的量浓度;m 为用于测定所取油样质量。

2 结果与讨论

2.1 酶解提取工艺优化

根据前期单因素实验结果，对提取温度、酶用量、提取时间、乙醇体积分数4 个因素进行正交优化，以金银花绿原酸提取率为考察指标，因素与水平见表1，结果见表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

由表2 可知，4 个因素对提取效果的影响程度大小为酶用量﹥提取时间﹥提取温度﹥乙醇体积分数，确定最佳的工艺条件为:A2B2C1D2，即酶用量0.6%，提取时间60 min，提取温度55 ℃，乙醇体积分数70%。在该最佳工艺条件下，重复3 次平行实验，得金银花绿原酸平均提取率为4.85%。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal test

2.2 HPLC 色谱检测分析

将金银花绿原酸样品研成细粉，称取细粉约0.5 g，加入50% 甲醇50 mL，超声处理15 min，过滤。吸取滤液5 mL，加50% 甲醇至25 mL，即为提取样品溶液。绿原酸对照品与提取样品溶液各20 μL分别进样测定，结果见图1 和图2。

图1 绿原酸对照品HPLC 图Fig.1 HPLC chromatogram of standard chlorogenic acid

图2 金银花绿原酸HPLC 图Fig.2 HPLC chromatogram of chlorogenic acid from Lonicera Japonica

绿原对照品在图1 中的出峰时间为3.13 min，图2 中在3.13 min 也出现绿原酸最大吸收峰出峰，由此可以推断，提取产品主要成分为绿原酸。

2.3 羟基自由基OH·的清除能力

金银花绿原酸与维C 对OH·清除的结果见图3。

图3 金银花绿原酸与维C 对OH·的清除率Fig.3 Effects of chlorogenic acid from Flos Lonicerae and VC on the OH· scavenging rate

由图3 可知，在0.2 ～0.5 mg/mL 质量浓度范围内，金银花绿原酸显示出一定的抗氧化性，且随着质量浓度的升高，它对OH·的清除能力增强，其最大清除率为61.26%。而同样质量浓度下，维C 的最大清除率为56.23%。

为了更好的说明测试样品的抗氧化性，对图3中清除率曲线进行统计回归，OH·清除率与不同待测物浓度的对数呈线性关系，回归方程分别为y =18.20 lnx +74.62(金银花绿原酸)，R2=0.994 0;y=12.65 lnx+ 65.80(维C)，R2=0.996 0。

以OH·被消耗掉50%所需抗氧化剂的用量(半抑制量IC50)来表征，在清除OH·体系中，金银花绿 原 酸IC50为0. 258 6 mg/mL，维C IC50为0.286 8 mg/mL。IC50越小，清除自由基的能力越强，因此，对OH·清除效果金银花绿原酸比维C略好。

2.4 超氧阴离子自由基O2－·的清除能力

金银花绿原酸与维C 对O2－·清除的结果见图4。

图4 金银花绿原酸与维C 对2·的清除率Fig.4 Effects of chlorogenic acid from Flos Lonicerae and VC on the O2－· scavenging rate

由图4 可知，在0.1 ～0.4 mg/mL 质量浓度范围内，显示出金银花绿原酸具有很强的清除O2－·的能力，且随着质量浓度的升高，清除效果更好，其最大清除率为94.81%，而同样质量浓度下，维C 的最大清除率为74.25%。

对图4 中清除率曲线进行统计回归，回归方程分别为y=40.23 lnx+132.5(金银花绿原酸)，R2=0.994 0;y=115.6 x+29.67(维C)，R2=0.989 0。

在清除O2－·体系中，金银花绿原酸IC50为0.128 6 mg/mL，维C IC50为0.175 9 mg/mL，因此金银花绿原酸对O2－·清除效果较好。

2.5 猪油抗氧化能力

将配好的7 份试样放入恒温箱65 ℃，每隔2 d，取样测定猪油的过氧化值，观测期为18 d。金银花绿原酸及VC 对猪油的抗氧化能力见图5。

图5 油脂过氧化值随时间变化Fig.5 The changes of POV value

由图5 可知，在猪油中添加不同浓度提取物金银花绿原酸和维C 后，所有测试组的POV 值都明显低于空白油脂的值，说明提取物金银花绿原酸和维C 对猪油都具有较好的抗氧化能力。当金银花绿原酸添加量为360 mg/kg 时，抗油脂氧化能力最好;维C 在添加量为360 mg/kg 时，在实验系列浓度内，也有相同的趋势表现。因此可以推断，测试样品的抗氧化能力是随其添加量的增加而增强的。金银花绿原酸有更出色的表现，将POV 值在观测期内维持在5.5 mol/g 以下。

3 结论

(1)通过正交实验优化了纤维素酶解法提取金银花绿原酸的工艺条件，最佳酶解工艺条件为:提取温度55 ℃，酶用量(对底物浓度)0.6%，提取时间60 min，乙醇体积分数70%。此条件下，金银花绿原酸平均提取率为4.85%。该研究工艺具有提取条件温和、操作时间短，能够极大的保证提取产品活性的特点。

(2)在体外抗氧化活性的研究中，金银花绿原酸抗氧化能力与绿原酸浓度在一定范围内成剂量关系。金银花绿原酸添加量0.5 mg/mL 时，对OH·的清除率达61.26%，IC50为0.258 6 mg/mL，比维C效果略好。添加量0.4 mg/mL 时，对O2－·的清除率高达94.81%，IC50为0.128 6 mg/mL，清除效果明显优于维C。金银花绿原酸在恒温65 ℃下，将POV值在18 d 内维持在5.5 mol/g 以下，金银花绿原酸具较强的清除自由基及抗脂质过氧化能力。

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