薄层色谱法测定牛奶、蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物残留

杨勇　罗奕　+吴琳琳　罗曼　茅向军　杨微微　王俪瓯

摘要：建立动物源性食品牛奶及蜂蜜中诺氟沙星、环丙沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星等6种氟喹诺酮类药物残留快速筛查的薄层色谱法。该方法中，样品经5%乙酸乙腈提取，经改进的QuEChERS方法净化，采用薄层色谱法对样品中6种氟喹诺酮类药物残留物进行检测。结果表明：该方法对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、双氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星的检出限分别为10、10、10、10、2、20 μg/kg；经薄层色谱法检测，在15批牛奶样品中检出 3批疑似阳性样品，在15批蜂蜜样品中检出7批疑似阳性样品；通过最终质谱确认，15批牛奶样品中检出1批阳性样品，15批蜂蜜样品中检出2批阳性样品。该方法耐受性好，可简单、快速适用于牛奶、蜂蜜中氟喹诺酮类残留的大批量筛选。

关键词：牛奶；蜂蜜；氟喹诺酮类药物；残留量；薄层色谱法

中图分类号： TS207.5 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0380-04

氟喹诺酮类（FQs）系化学合成药物，因价格低廉、抗菌活性强，在医学特别是在兽医学中应用广泛。由于致病菌产生的耐药性和某些FQs的潜在致癌性质，其残留问题已引起广泛关注[1-4]。氟喹诺酮类检测是动物源性食品中药物残留分析的重要研究内容。检测氟喹诺酮类药物残留的方法有微生物法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱检测法等[5-6]，牛奶、蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留检测方法主要为高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱法，运用薄层色谱法进行检测的研究较少。用于检测食品中喹诺酮类药物残留的国家标准GB 29692—2013《牛奶中喹诺酮类药物残留的测定》和GB/T 23412—2009《蜂蜜中喹诺酮类药物残留的检测》均采用液相色谱-质谱/质谱法测定氟喹诺酮类残留。由于仪器设备昂贵、检测方法复杂、试验成本高的限制，该方法在国内普及还需要较长时间。本研究应用近年来在兽药残留检测中应用日趋广泛的分散固相萃取样品前处理净化技术（quickly，easy，cheap，effective，rugged，safe，QuEChERS）[7-11]，用薄层色谱法对牛奶、蜂蜜中氟喹诺酮类残留进行筛选，以期找出更为经济简便、更适用于基层部门监管食品安全的氟喹诺酮类药物残留检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

牛奶样品、蜂蜜样品各15批，均为市售。6种氟喹诺酮类标准品：恩诺沙星（纯度为98.50%，货号为C 13170000，批号为lot：91111）、沙拉沙星（纯度为95.50%，货号为C 16908000，批号为lot：10407）、双氟沙星（纯度为97.50%，货号为C 12627000，批号为lot：91103）、诺氟沙星（纯度为9950%，货号为C 15648000，批号为lot：10214）、环丙沙星（纯度为95.00%，货号为C 11668500，批号为lot：00526）、丹诺沙星（纯度为94.00%，货号为C 11960500，批号为lot：00920），以上标准品均来自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 仪器与试剂

仪器：ATS-4型自动点样仪[瑞士CAMAG（卡玛）公司]；TD6M型医用离心机（长沙平凡仪器有限公司）；BT2202S型电子分析天平（德国Sanorius公司）；TALBOYS 型涡旋仪（美国亨利特里姆有限公司）。

试剂：乙腈（色谱纯，美国天地试剂公司）；冰乙酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；三乙胺 （分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；N-正丙基乙二胺（PSA）（美国SELECTRA公司）；正己烷（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司 ）；无水硫酸镁（分析纯，天津市美琳工贸有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司）；薄层板（Merck板，尺寸为100 mm×200 mm）。

1.3 对照品溶液的制备

1.3.1 标准贮备溶液 分别称取恩诺沙星10.11 mg、沙拉沙星10.27 mg、双氟沙星10.22 mg、诺氟沙星10.89 mg、环丙沙星10.70 mg、丹诺沙星10.81 mg，置于10 mL容量瓶中，加入20 μL甲酸和适量甲醇溶解，最后用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别吸取上述溶液1 mL置于100 mL容量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀释至刻度，摇匀，即得恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、丹诺沙星浓度分别为9.958 3、 9.907 8、9.964 5、10.835 6、10.165 0、10.161 4 μg/mL的标准贮备溶液。

1.3.2 混合标准使用溶液 分别吸取恩诺沙星、双氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星标准贮备溶液1 mL，沙拉沙星标准贮备溶液5 mL，丹诺沙星标准贮备溶液0.2 mL，置于同一个10 mL量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀释至刻度，摇匀，即得0.995 8 μg/mL恩诺沙星、 4.904 1 μg/mL沙拉沙星、 0.996 4 μg/mL双氟沙星、1.083 6 μg/mL诺氟沙星、1.016 6 μg/mL环丙沙星、 0.203 2 μg/mL丹诺沙星的混合标准使用溶液（临用前现配）。

1.4 供试品溶液的制备

1.4.1 牛奶样品溶液的制备 称取牛奶样品10 g于50 mL离心管中，加入5%乙酸乙腈溶液15 mL，涡旋1 min；加入无水硫酸钠1.5 g和无水硫酸镁6 g，涡旋5 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液于另1个50 mL离心管中，加入正己烷5 mL，涡旋1 min，分取下层溶液。将上述残渣加入10 mL 5%乙酸乙腈溶液中，涡旋1 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液经同一份正己烷萃取，合并下层溶液，置于50 ℃水浴锅上蒸干。将上述残渣加入2 mL 0.2%甲酸水溶液中，再加入PSA净化剂0.2 g和无水硫酸镁0.5 g，涡旋1 min，4 000 r/min离心5 min，上清液过0.45 μm微孔滤膜，备用。endprint

1.4.2 蜂蜜样品溶液的制备 称取蜂蜜样品5 g，置于100 mL离心管中，加入Mcllvaine缓冲液约5 mL，涡旋1 min；加入5%乙酸乙腈溶液至50 mL，涡旋10 min；加入无水硫酸镁5 g，涡旋2 min。5 000 r/min离心5 min，吸取上清液 25 mL 至蒸发皿中于50 ℃水浴蒸干，加0.2%甲酸水溶液2 mL，加入PSA净化剂0.2 g，涡旋1 min，离心，取上清液过 0.45 μm 微孔滤膜，备用。

1.5 点样

在同一默克薄层板上，距板底边13 mm处依次点6种氟喹诺酮标准使用溶液、混合对照溶液和供试品溶液各5 μL，将溶液点成带状，带状宽度为3 mm。

1.6 展开及检视

以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（体积比 15 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 2 ∶ 1）为展开剂，饱和15 min后上行展开，取出，晾干，再喷3%三氯化铽乙醇溶液，100 ℃烘1 min，取出，冷至室温，在365 nm波长下检视。

2 结果与分析

2.1 样品结果判断

如果供试品色谱中与对照色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，被视为疑似阳性样品。试验表明：15批牛奶样品供试品色谱中，有3批样品在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，则视为疑似阳性样品，分别是2号、4号、11号样品，其他样品在与对照品色谱相应位置上均未显相同颜色的斑点，初步判断其他12批样品中未检出6种氟喹诺酮类药物残留物。15批蜂蜜样品供试品色谱中，有6批样品在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，则视为疑似阳性样品，分别是17号、19号、26号、27号、28号、29号样品，其他9批样品在与对照品色谱相应位置上均无显相同颜色的斑点，初步判断其他9批样品未检出6种氟喹诺酮类药物残留物。从牛奶检测结果图谱（图1）可见，基质对样品测定结果基本无干扰，说明牛奶样品前处理方法是适用的；从蜂蜜检测结果图谱（图2）可见，蜂蜜基质对样品测定结果有干扰，说明蜂蜜前处理方法不够完善。

2.2 专属性

取对照品溶液和自制模拟样品溶液用点样仪点样，然后展开及检视。结果表明，该方法专属性强，阴性样品无干扰，适用于牛奶、蜂蜜中6种氟喹诺酮类药物的快速筛查。结果见图3。

2.3 检出限

供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜色（或荧光）不得更深。结果表明，牛奶、蜂蜜中环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、双氟沙星的检出限均为10 μg/kg，丹诺沙星的检出限为2 μg/kg，沙拉沙星的检出限为20 μg/kg。

2.4 质谱确认结果

将疑似阳性样品经过质谱确认，结果显示所有疑似阳性样品中有3批为阳性样品，其余几批均为假阳性样品。质谱确认结果见表1，色谱图和质谱图见图4至图9。

2.5 展开剂的考察

分别考察了5种展开系统：（1）四氢呋喃-乙酸乙酯-异丙醇-氨水（体积比4 ∶ 3 ∶ 6 ∶ 3）；（2）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（体积比16 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 3）；（3）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（体积比15 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 3）；（4）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水（体积比15 ∶ 10 ∶ 7 ∶ 3）；（5）三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-氨水-水（体积比15 ∶ 10 ∶ 4 ∶ 2 ∶ 1）。结果表

明，系统1中6种喹诺酮只呈现4个点，其中丹诺沙星和沙拉沙星、恩诺沙星和双氟沙星无法分离；系统2中6种喹诺酮只呈现5个点，其中丹诺沙星和沙拉沙星无法分离；系统3/系统4中丹诺沙星和沙拉沙星无法分离；只有系统5中6种喹诺酮均能分离，且Rf值为0.2～0.8。故选择系统5为展开剂，饱和15 min，直立上行展开8～10 cm，取出，晾干。在紫外波长365 nm下观察6种氟喹诺酮的斑点，并测量Rf值进行定性。

2.6 显色剂的考察

分别考察了3%三氯化铋乙醇溶液、3%三氯化铽乙醇溶液2种显色剂，在波长365 nm 下检视。结果显示，3%三氯化铽乙醇溶液显色后在波长365 nm下斑点明显易于观察。另外考察了1%、3%、5%、7%三氯化铽乙醇溶液的显色效果，结果显示， 3%三氯化铽乙醇溶液显色后在波长365 nm下斑

点明显易于观察、无扩散。故选择3%三氯化铽乙醇溶液作为最终显色剂。

2.7 薄层板的选择

在选定条件下，分别运用国产高效硅胶G 预制板、国产普通硅胶G 预制板、自制板、H板、Merck板，观察分离效果。结果表明，在Merck板中的分离效果优于其他薄层板，斑点清晰，条带无扩散，因此选择Merck板进行薄层鉴别。

2.8 耐受性考察

用不同浓度的硫酸溶液来控制薄层板的相对湿度，观察

展开剂在5种湿度下的展开情况。结果显示，湿度为32%～72%时，均能获得较好的分离效果。分别在高温（40 ℃）、室温（20 ℃）、低温（4 ℃）环境下考察温度对展开效果的影响，发现在各温度条件下均能获得较好的分离效果。

2.9 净化剂及其用量选择

目前对于氟喹诺酮类药物残留的净化大多数选择固相萃取。但是此方法操作步骤繁琐、费用较高且回收率普遍偏低。本研究对近年来在农药、兽药残留应用广泛的样品前处理技术QuEChERS进行了探索。目前分散固相萃取技术常用的吸附剂有C18 、NH2、PSA、PAX 等4种，根据牛奶基质特点，选取C18、PSA比较其净化效果及其对目标物的影响。试验表明，2种吸附剂对目标物的影响没有明显区别，但C18对牛奶中蛋白质和蜂蜜中糖提取物净化效果有限，故采用PSA作为净化剂。比较0、25、50、75、100、150、200 mg/mL PSA下的净化效果，发现过量使用吸附剂会吸附目标化合物，吸附剂使用较少时净化效果不佳，当吸附剂用量为100 mg/mL时目标物几乎无损失，且净化效果较好。因此选择PSA净化剂用量为100 mg/mL。endprint

3 结论

本研究建立了牛奶、蜂蜜中诺氟沙星、环丙沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星等6种氟喹诺酮类的快速检测方法，即薄层鉴别法。本方法简单、快速，灵敏度高，检出限均可满足兽药残留筛查检测要求。本方法为牛奶、蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留监测提供了简单、快速的前处理和检测手段，适用于大批量牛奶、蜂蜜样品中氟喹诺酮类药物残留的筛选。本方法也适合其他对象中该类兽药残留的监测，为食品安全快速检测研究提供了研究基础。参考文献：

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