周麦11、西农1163—4抗叶锈病基因与周8425B中LrZH84的关系

张培培　周悦　董海焦　殷贵宏　李在峰　刘大群

摘要：为了明确周麦11、西农1163-4抗叶锈病基因与周8425B中LrZH84的关系，用叶锈菌小种THTT接种周麦11/中国春的145个F2单株，而另一叶锈菌生理小种FHTT分别接种周麦11/中国春的285个F2单株、西农1163-4/Thatcher的232个F2单株；2个与LrZH84紧密连锁的标记gwm582、ω-secalin/Glu-B3用于检测3个群体中是否携带抗叶锈病基因LrZH84。结果显示：周麦11对叶锈菌生理小种THTT的抗性由2个显性抗病基因控制，经标记检测发现，周麦11中1个抗病基因是LrZH84，另1个抗叶锈病基因为未知基因；周麦11对叶锈菌生理小种FHTT的抗性由单基因控制，标记检测发现该基因不同于LrZH84，为未知抗叶锈病基因；西农1163-4对叶锈菌生理小种FHTT的抗性由单基因控制，分子标记检测结果表明，该基因可能为LrXi，由于LrZH84对FHTT表现感病，表明LrXi不同于LrZH84。通过研究证实，周麦11中含有LrZH84和1个未知的抗叶锈病基因，西农1163-4中的抗叶锈病基因LrXi与LrZH84不同；同时，周麦11、西农1163-4中可能还含有其他抗病基因，有待进一步研究。研究将为抗病基因聚合、基因布局、培育抗病新品种奠定理论基础。

关键词：小麦；抗叶锈病基因；基因鉴定；周麦11；西农1163-4；周8425B；LrZH84

中图分类号：S435.121.4+3 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）10-0033-03

禾本科作物小麦（Triticum aestivum L.）是全世界重要的粮食作物，其总产量仅次于玉米，至今已有5 000多年的种植历史，全世界35%～40%的人口以小麦为主粮。小麦叶锈病是由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）引起的世界性病害，主要为害小麦叶片，很少发生在叶鞘及茎秆上，小麦叶锈病主要通过影响小麦的光合作用而最终影响小麦产量，其在全球小麦种植区包括北美洲、欧洲、亚洲、澳洲、非洲等许多国家都有发生，在流行年份会造成高达40%的产量损失[1]，我国分别于1969、1973、1975、1979、2012年发生5次小麦叶锈病大流行[2]。虽然杀菌剂可以控制小麦锈病的发生与危害，但是培育和利用抗锈病的小麦品种，科学地在时间和空间上布局含有不同抗性基因的小麦品种，对于防止叶锈病大暴发，是最为经济、环保、有效的措施。

小麦抗叶锈性主要包括垂直、水平抗性两类。垂直抗性又称生理小种专化抗性、质量性状抗性、苗期抗性或主效基因抗性等，它在遗传上受1个或少数几个主效基因控制，受环境影响小，抗性易丧失；水平抗性又称非小种专化抗性、数量性状抗性或微效基因抗病性，也叫成株慢锈性，在遗传上受多个微效基因控制，受环境影响大，抗性较为持久[3]。到目前为止，已有72个抗叶锈病基因被正式命名[4]，其中慢锈性基因只有Lr34、Lr46、Lr67、Lr68[5-9]，大多数为小种专化抗性基因。这些抗病基因符合基因对基因假说，往往会由于病菌小种的变异而很快“丧失”抗性。目前，我国小麦中有效抗病基因缺乏，仅有少数几个抗病基因，如Lr9、Lr19、Lr24、Lr38等对我国的小麦叶锈菌具有良好抗性[10]。因此，研究我国小麦抗叶锈病遗传规律，不断发掘和定位我国小麦材料中的抗叶锈病基因，对利用基因操作持久控制小麦叶锈病具有重要的理论和实际意义。近年来，笔者所在实验室在小麦叶锈病的研究方面取得了一定进展，Zhao等在小麦品种周8425B中定位了1个苗期抗病基因LrZH84，位于1BL染色体上，该基因与SSR标记gwm582、barc8紧密连锁；此外发现，周8425B中还携带已知抗叶锈病基因Lr26，目前Lr26对我国多数叶锈菌生理小种已丧失抗性[11]。李星等在西农1163-4中定位了1个苗期抗病基因LrXi，该基因同样位于1BL染色体上，并且位置与LrZH84接近[12]。Zhou等通过等位性检测试验发现，LrZH84、LrXi位置相近，为等位基因或者紧密连锁的2个基因[13]。

周麦11（豫麦51 号）为河南省周口市农业科学院杂交育成的新品种，具有高抗小麦叶锈病、条锈病、白粉病、赤霉病以及高产等特点，在抗病育种和生产上具有重要应用价值。周麦11来自于周8425B/豫麦17，抗性比周8425B好，利用周麦11和中国春杂交得到的F2群体可确定周麦11中的抗叶锈基因，还可进一步确定周麦11中的抗病基因与LrZH84的关系。西农1163-4对中国大多数小种表现为高抗。LrZH84、LrXi为等位基因，但是这2个基因是否为同一个基因有待进一步研究。本试验的目的就是确定周麦11中的抗病基因和LrZH84的关系，以及LrZH84和LrXi的关系，以期为抗病基因聚合、基因布局和培育抗病新品种奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 小麦材料与叶锈菌菌种

抗病亲本周麦11与感病亲本中国春进行杂交自交获得了2个F2群体，群体大小分别为145、285个单株，抗病亲本西农1163-4、感病亲本Thatcher进行杂交自交获得了232个F2单株。供试菌种材料为THTT、FHTT，由河北农业大学锈病研究中心保存，致病类型按Long等的小麦叶锈菌密码命名系统（Prt-code System）[14]命名。

1.2 菌种的纯化及扩繁

将菌种于冰箱中取出，在40～45 ℃水中活化5～10 min，然后于黑暗水化10 h；水化后，采用涂抹法将菌种接种于感病品种郑州5389上。当第1张叶片完全伸展时，先用手指蘸取清水脱除叶片表面腊质层，以便于叶锈菌的侵染，再将叶锈菌孢子轻涂于叶片正面。接种后喷洒0.05%吐温液，在黑暗中保湿16～24 h后，置于温室内。叶片现斑时，进行单侵染点分离。分离后放置于光照培养箱中，采用培养温度18 ℃、光照时间14 h进行离体培养。接种6～7 d后，叶片上出现孢子堆，10 d左右孢子堆成熟。因单个孢子堆获得的菌量太少，先在离体的完整叶片上进行1次繁殖，待孢子堆成熟后接种于感病品种郑州5389上进行菌种的扩繁。

1.3 苗期抗叶锈菌鉴定

周麦11/中国春的145个F2单株群体接种叶锈菌生理小种THTT，周麦11/中国春的285个F2单株、西农1163-4/Thatcher的232个F2单株接种叶锈菌生理小种FHTT。THTT对中国春有致病力，对西农1163-4、周麦11、周8425B均无致病力；FHTT对周8425B、中国春、Thatcher有致病力，对西农1163-4、周麦11均无致病力。鉴定材料种植于温室中，当小麦的第1张叶片完全展开时，用扫抹法接种小麦叶锈菌菌种。接种后，在15 ℃、100%相对湿度条件下黑暗放置24 h，之后转入温室中。接种后15 d发病充分时，进行表型鉴定，鉴定时按照0、；、1、2、3、4等6级标准调查记载反应型[15]。根据F2代植株的抗感分离比例，确定这些材料中所含抗叶锈基因的遗传方式，用卡方值检验其适合度。

1.4 DNA提取

参照Sharp等提供的CTAB法[16]提取小麦叶片基因组DNA，用紫外分光光度计测定DNA浓度、相对纯度，用ddH2O将DNA稀释成浓度为50 ng/μL备用。

1.5 分子标记检测

2个与LrZH84紧密连锁的标记gwm582、ω-secalin/Glu-B3[11]用于检测周麦11与中国春、西农1163-4与Thatcher杂交并自交所得的F2群体。PCR反应体系及反应程序见表1。

2 结果与分析

2.1 周麦11抗叶锈病基因的遗传解析

叶锈菌生理小种THTT在苗期接种周麦11、中国春及其杂交自交获得的145个F2单株，抗病鉴定结果（表2）表明，周麦11对叶锈菌生理小种THTT表现为高抗（反应型为1），中国春表现为高感（反应型为4）；145个F2单株中，137株表现为抗病（反应型为0～2），8株表现为感病（反应型为3～4）。经过卡方（χ2）检验其适合度，结果表明后代符合15 ∶ 1的分离比（χ215 ∶ 1 =0.133，1df，P>0.25），说明周麦11的抗性由2对抗叶锈病基因控制。苗期基因推导结果显示，所有对周8425B表现无毒性的小种（PHQT、FCQR、FCST、PCBT、TCGT、PGSN、FGSQ、FKQT、PCHS、FBHT、FHST、PHSS、FHGS、FHTS、PGTT、PCJT、PHST、FHHQ、FHTR、PHJT、THTT、FCTT、PCGR）对周麦11均表现抗病[17-18]，由于周麦11来源于周8425B和豫麦17，因此周麦11中1个抗病基因可能是LrZH84，而另1个抗病基因则可能来源于豫麦17。进一步用2个与LrZH84紧密连锁的标记gwm582、ω-secalin/Glu-B3检测8个感病单株，全部为感病亲本中国春的带型，这就证实周麦11中1个抗病基因为LrZH84。

在另1个苗期试验中，叶锈菌小种FHTT接种周8425B、周麦11、中国春、周麦11/中国春的285个F2单株，鉴定结果（表2）显示，周麦11对叶锈菌生理小种FHTT表现抗病（反应型为1）；周8425B、中国春均表现感病（反应型为4）；285个F2单株中，220株表现为抗病（反应型为0～2），65株表现为感病（反应型为3～4）。经过卡方（χ2）检验其适合度，结果表明后代符合3 ∶ 1的分离比（χ23 ∶ 1=0.730 9，1df，P>0.25），说明周麦11对叶锈菌生理小种FHTT的抗性由1对基因控制。2个与LrZH84紧密连锁的标记gwm582、ω-secalin/Glu-B3检测10个抗病单株、10个感病单株，结果表明该抗病基因与LrZH84位置不同。由于LrZH84对小种FHTT感病，因此周麦11中对FHTT的抗性由另外1个未知小麦抗叶锈病基因提供。

2.2 西农1163-4中抗叶锈病基因与LrZH84的关系

叶锈菌小种FHTT接种周8425B、西农1163-4、Thatcher，以及西农1163-4、Thatcher杂交自交所得232个F2单株。

表3结果显示，周8425B表现感病，反应型为4级；西农1163-4对叶锈菌生理小种FHTT表现为高抗，反应型为1；Thatcher表现为高感，反应型为4；232个F2单株中，172个单株表现为抗病（反应型为0～2），60个单株表现为感病（反应型为3～4）。经过卡方（χ2）检验其适合度，结果表明后代符合3 ∶ 1的分离比（χ23 ∶ 1=0.092，1df，P>0.75），说明西农1163-4的抗性由1对抗叶锈病基因控制。2个与LrZH84紧密连锁的标记gwm582、ω-secalin/Glu-B3检测西农1163-4、Thatcher杂交所得的10个抗病单株和10个感病单株，电泳结果表明，该基因同标记是紧密连锁的，根据其位置可知[12]，小种FHTT鉴定出的抗病基因很可能是LrXi。这些结果表明，LrXi对FHTT表现抗性，而LrZH84对FHTT表现感病，由此可知尽管LrXi、LrZH84的位置相同或相近[13]，但它们却是2个不同的抗病基因。

3 结论与讨论

3.1 周麦11、西农1163-4中的抗病基因

周麦11抗性优于周8425B，根据试验结果可知，周麦11中除了携带LrZH84外还有1个未知的抗叶锈病基因，目前正在进行该基因的定位工作。西农1163-4对中国的大多数生理小种表现为抗病[12]，抗性优于周8425B，可能还含有其他抗叶锈病基因，需要利用其他生理小种进行进一步鉴定。目前发现的多数小麦抗叶锈病基因具有小种专化性，当新毒性小种出现时其抗病性就会丧失，因此在生产上需要不断发掘和定位新抗病基因来应对新毒性小种的不断涌现，周麦11、西农1163-4都有良好的抗病性，明确其中所携带的抗病基因是非常有必要的。

3.2 我国小麦抗叶锈病育种

我国抗叶锈小麦资源丰富，但对于我国小麦品种及种质中的抗叶锈基因及基因布局了解很少。早在20世纪70年代携带有1BL.1RS易位系（Lr26）的品种如洛夫林13、山前麦、高加索、牛朱特及其的衍生品系被广泛运用于我国小麦育种[19]，结果导致一半以上的小麦携带1BL.1RS易位系[17，20]，造成我国小麦抗叶锈基因单一，新叶锈菌生理小种的产生使得Lr26对目前叶锈菌丧失了抗性。因此，使用多系品种、聚合育种、抗病品种的合理布局、利用成株慢锈性品种等方法，可以有效地防止抗病基因的丧失，这些方法的核心是实现抗病基因的合理利用，使抗病基因和病菌毒性基因互作趋于稳定状态，从而延缓毒性小种产生和发展。无论采取何种途径，要实现小麦品种抗叶锈病基因多样化，必须掌握丰富的明确抗病基因的抗源，只有了解抗源的基因背景和抗病基因遗传特点，才能对其合理利用。因此，广泛收集抗源并对其抗病基因进行鉴别，了解不同抗病基因的遗传特点，有助于合理并有效地利用抗病基因；同时应在小麦育种中发掘和利用新的抗病基因，扩大与充实抗病基因库，为培育抗病品种提供更加丰富广泛的抗源和抗病基因。

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