糖皮质激素诱导重组转基因二元载体pElrLEG的构建

王宏归，黄 晨，姜 雅，严秋香，周春洪

(1.扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州225127;2.扬州大学测试中心，江苏扬州225009)

常见的诱导型载体有四环素类、糖皮质激素类、雌激素类、酒精类、蜕皮(Ecdysone)激素类、金属类。这些类型的诱导载体各有优劣。四环素诱导型载体，其四环素使用量大，不仅对细胞产生毒害，而且对环境也会造成危害;雌激素诱导型载体，由于雌激素在植物体内不易扩散，局部诱导性强，因此不适宜对整株植物诱导;蜕皮激素诱导型载体，其缺点是叶片对蜕皮激素吸收差;酒精诱导型载体，其缺点:酒精对植物有毒害作用，且易挥发;铜诱导型载体，诱导素元铜对细胞有毒害作用，且其扩散有限;地塞米松是糖皮质激素诱导型表达载体的诱导剂，不仅无毒，而且可以高效地被运输到植物的各个组织。

正因为地塞米松具有以上优点，所以糖皮质激素诱导型表达载体适合用于植物转基因。目前研究大部分都是将GR-Cre重组酶片段和Loxp位点分别构建在2个Ti质粒的T-DNA上，要实现Loxp位点的重组，必须将2个质粒的转基因植株进行杂交，如果将GR-Cre重组酶片段和Loxp位点同时构建在同一个载体上，那么Loxp位点的重组无需通过杂交，这样既可以节省时间也可以减少工作量［1－3］。

由于重组酶能使Loxp位点的DNA发生重组，而DNA位于细胞核内，因此，Gre只能在细胞核内起作用。Cre与GR的融合蛋白，在不外加地塞米松时，GR-Cre通过GR结合在内质网上，DNA重组不能发生;当有地塞米松时，GR-Cre通过GR与地塞米松结合，使得GR-Cre从内质网上脱落，进入细胞核内，结合到Loxp位点上，引发重组［4－5］。在Loxp位点之间还含有一个Gateway cassette和多克隆位点(MCS)，Gateway克隆技术的优点是不受酶切位点的限制，该载体的Gateway cassette含有attR1和attR2两个重组位点，这个位点用于克隆不同的启动子，而多克隆位点(MCS)位于Gateway cassette的后面，用于目的基因的克隆［6］。位于loxP位点之间的DNA，将在外加地塞米松的情况下，引发DNA重组而被敲除［7－11］。

1 材料与方法

1.1 材料 试验所用菌株是DH5α 与DB3.1，DB3.1用于进行克隆或者扩繁含有Gateway片段的质粒［6］。质粒是pJawoh18-RNAi、pCre、pUC57。限制性内切酶及 T4DNA 连接酶均购自于NEB公司。PCR引物由primer5设计，PrimerSTAR TM HS Polymerase购自于TaKaRa公司。试验中使用的引物:GR-Cre F:CGGGCTAGCATGTCCAATTTACTGACCGTACAC，R:CGG CCATGGTCATTTTTGATGAAACAGAAGCTT，2 059 bp;GatewayF:CGGCGTACGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCT GA，CassetteR:CGGGGTACCACCACTTTGTACAAGAAAG CTG1，1 706 bp。

1.2 方法 PCR反应体系:模板DNA 0.5 μl，正反向引物(10 μmol/L)各 1 μl，10 × buffer 5 μl，dNTPs(10 mmol/μl)5 μl，DNA 聚合酶 0.5 U，加水补齐 50 μl。酶切体系:DNA 1 μg，buffer 2 μl，内切酶各加1 U，加水补齐20 μl，37 ℃酶切过夜，连接体系:载体:目的片段为 1∶3～1∶9，T4连接酶 1 U，buffer 2 μl，加水补齐 20 μl，4 ℃连接过夜。

2 结果与分析

2.1 Loxp-nos-Loxp(XhoI-SofI-Loxp-NheI-NcoI-NOS-BsiwI-KpnI-StuI-BgIII-MfeI-AatII-1xMyc-Loxp-SpeI)片段的合成 Loxp-nos-Loxp(南京金斯瑞生物科技公司合成)是以XhoI及SpeI位点克隆在pUC57载体上。该片段含有2个同向Loxp位点，NOS终止信号序列位于NcoI与BsiwI位点之间。Myc标签用于蛋白表达检测，多克隆位点用于克隆基因(图1)。

2.2 工程质粒的构建 以pJawoh18-RNAi二元载体为骨架，利用XhoI及SpeI酶切位点将Loxp-nos-Loxp克隆到pJawoh18-RNAi载体上，即pElrL载体(图2)。利用GR-Cre的引物从pCre载体［12－13］上扩增 GR-Cre片段，再利用 NheI与NcoI酶切位点，将GR-Cre克隆到pElrL载体上，即pElrLC载体(图2)。将Gateway扩增片段，经BsiwI与KpnI酶切后并回收，并克隆至pElrLC上，即pElrLCG载体(图2)。

3 讨论

Cre是从噬菌体P1分离出来的DNA特异位点重组酶。Loxp位点是Cre识别位点，其最早也是在P1噬菌体中被发现。loxP在两端有13个反向重复的碱基，中间核心序列是8个非回文结构的碱基，共34个碱基。Cre重组酶识别并结合在loxP位点的两端，并从中间核心序列区将loxP切开。2个同向的loxP位点，在重组酶的作用下将2个loxP切开从而产生4个黏性末端，loxP位点之间的序列会自我连接成环，从而从基因组中环出丢失。

pElrLCG该载体的优点:①地塞米松作为诱导化学物质对植物无毒害作用，而且可以高效地被运输到植物的各个组。②该载体可以同时使用Gateway克隆技术以及常规酶切连接克隆技术。③GR-Cre重组酶表达后，可以通过是否施加地塞米松来控制Cre的入核，从而人为控制何时把转入的基因从基因组中删除掉。④该载体在杂交育种中也有很大潜力，如花粉不育的性状优良的母本，利用含有目的基因的载体即可得到花粉可育(转基因)和花粉不育(转入的目的基因环出丢失)的植株，这样花粉可育的植株可以用来繁殖种子，而花粉不育的植株可以用作杂交育种的母本。⑤该载体的Myc标签可以用于检测转入的基因是否表达。⑥该载体在施加地塞米松诱导后，GR-Cre进入核引发Loxp位点重组，Loxp位点之间的DNA片段从基因组里环出，由于环出的DNA片段包含了GR-Cre以及转入的基因，而又不含有启动子与3'末端加尾信号。因此，只要Loxp位点重组发生，GR-Cre及目的基因的转录即终止。总之，该载体在实现转基因，可以选择性地关闭/删除目的基因。

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