DNA条形码技术在深圳鱼肉制品鉴定中的应用

王 敏，刘 荭，黄 海，赵晓萌，石 琼，何舜平,4，孙 颖,*

（1.深圳华大基因研究院，广东 深圳 518083；2.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045；3.三亚市南繁科学技术研究院，海南 三亚 572000；4.中国科学 院水生生物研究所，湖北 武汉 430072）

DNA条形码技术在深圳鱼肉制品鉴定中的应用

王 敏1，刘 荭2，黄 海3，赵晓萌1，石 琼1，何舜平1,4，孙 颖1,*

（1.深圳华大基因研究院，广东 深圳 518083；2.深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045；3.三亚市南繁科学技术研究院，海南 三亚 572000；4.中国科学 院水生生物研究所，湖北 武汉 430072）

以线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因为目标基因，应用DNA条形码技术鉴别深圳批发市场和超市零 售鱼肉制品的种类来源，判别其产品标签是否正确。本研究调查的77 份鱼肉制品均能扩增出特异性条带，28 份样品与产品标签标示不符，“错贴”率高达36.36%，其中所有标示“龙俐鱼”的商品都是低价的“巴丁鱼”（Pangasianodon hypophthalmus）。DNA条形码技术可用于鱼肉制品的来源物种鉴定。

DNA条形码；COⅠ基因；物种鉴定；鱼肉制品

我国是鱼肉消费大国，鱼肉制品繁多，包括生鱼片、冷冻加工品（鱼片或鱼段）、烤鱼片和鱼糜制品等。近年来，鱼肉制品的掺假行为频频曝光，给人们的健康造成严重威胁[1-3]。鱼肉制品错贴标签的现象并非中国独有，一些欧洲国家的商贩也以次充好，赚取更高利润。如，在抽检的德国产鲽类鱼中，1/4与标注名称不符；24%的西班牙产虾肉样品中存在欺诈行为；在奥地利，一些价格昂贵的比目鱼、挪威三文鱼也通常成为假冒的对 象[4]。

DNA条形码的概念由加拿大生物学家Paul Hebert在2003年首次 提出[5-6]，是一种利用 线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（mitochondri al cytochrome C oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因，一段长度为648 bp的片段，对物种进行准确、快速鉴定的方法。在国外，DNA条形码技术已用于鱼肉制品的真假鉴别。Cawthom等[7]利用DNA条形码技术研究南非市场的鱼类，发现在批发商和零售商中贴错标签的比例差别巨大；Laura等[8]利用DNA条形码技术对意大利市场上的69 份鱼类样品进行分析，发现有22 个样本（32%）存在错贴标签现象；Wong等[9]利用DNA条形码技术对市场上的91 个样品进行分析，发现有25%的海产品的标签与实物不符；Holems等[10]研究了澳大利亚附近海域的221 份鱼翅样品，结果发现有许多鲨鱼被列入世界自然保护联盟红色名录，一种鲨鱼为极度濒危物种；美国海洋环境保护组织在2010—2012年期间通过DNA条形码技术研究全美境内1 247 份鱼类制品，发现有1/3的商品存在错贴标签现象[11]。但在我国DNA条形码技术主要集中在分类学和物种鉴定研究中[12-15]，而用于食品鉴定的文献报道较少，在鱼肉鉴定方面也是最近两年才有少量报道[16-18]。

本研究参照Ward等[19]的方法，选用COⅠ基因的通用引物，对深圳市场冷冻鱼、冻鱼片进行DNA提取、扩增和测序，并对线粒体COⅠ基因序列进行分析比对，旨在建立准确、高效的鱼肉制品的鉴定方法，为鱼肉制品进出口检验监管和市场安全监管等方面的应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2013年3月从市场上随机购买77 份鱼肉样品。其中59 份整鱼和冻鱼块在深圳梅林批发市场购得，其余18份鱼片和鱼柳等在深圳各超市购得。

无水乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇（ 均为分析纯）、EB核酸染料 生工生物工程（上海）股份有限公司；Tris-饱和酚（pH 8.0） 北京索莱宝科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs（2.5 mmol/L）、DNA Marker（DL100 bp） 广州瑞真生物科技有限公司；蛋白酶K 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

高速离心机 德国Eppendorf公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Life Technologies公司；水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；超净工作台 深圳市优之净环境科技有限公司；电泳仪 北京六一仪器厂；凝胶成像系统 上海天能科技有限公司；微量核酸蛋白测定仪 德国Implen公司。

1.3 方法

1.3.1 样本DNA提取

采用传统的酚-氯仿法。取10 mg左右的组织于1.5 mL的离心管中，加入494 μL DNA裂解液和6 μL蛋白酶K（20 mg/mL）；将离心管于56 ℃恒温水浴锅中裂解3 h，水浴完后，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，V/V）溶液，摇匀至乳浊液，离心10 min，12 000 r/min；吸取上清液，转入新的1.5 mL离心管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1，V/V）溶液，摇匀至乳浊液，离心10 min，12 000 r/min。吸取上清液，转入新的1.5 mL离心管中，加入2 倍体积无水乙醇溶液（提前预冷），颠倒混匀，－20 ℃静置30 min，离心10 min，12 000 r/min；弃去上清液，体积分数75%乙醇溶液洗涤2 次；烘干后加入50 μL dH2O，溶解DNA；取2 μL制备1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，同时吸取1 μL稀释后使用紫外分光光度计进行检测；将原液存放于－20 ℃冰箱保存。

1.3.2 COⅠ基因的PCR扩增和测序鱼类通用引物[19]：

FishF2_t1（5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCGACT AATCATAAAGATATCGGCAC-3’），VF2_t1（5’-TGTA AAACGACGGCCAGTCGACTAATCATAAAGATATCG GCAC-3’）；FishR2_t1（5’-TGTAAAACGACGGCCAG TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3’），FR1d_t1（5’-CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGA ARAAYCARAA-3’）。

PCR反应体系为25 μL：10×PCR Buffer为2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.0 μL，TaKaRa Taq（5 U/μL）0.5 μL，引物各0.25 μL，DNA模版1.0 μL，去离子水19.0 μL。PCR反应程序：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，52 ℃、40 s，72 ℃、1 min，35个循环；72 ℃、10 min。PCR扩增完成后，以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，挑选扩增成功且条带单一的产物送测。

1.3.3 序列比对及分析

将测序成功的序列人工比对拼接，将处理过的序列放到BOLD（http://www.boldsystems.org）以及NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）网站的数据库对样品的COⅠ序列进行鉴定以及相似度分析，再将整理后的序列和GenBank下载的相关序列应用DNAMAN 7.0软件进行多序列比对，分析相关序列的同源性。

2 结果与分析

2.1 样品DNA浓度及纯度

电泳检测显示，DNA质量正常；紫外分光光度计检测波长260 nm和波长280 nm处吸光度比值，即A260nm/ A280nm在1.8～2.0之间，满足常规PCR反应的要求。

2.2 COⅠ基因的扩增和克隆

图1 不同鱼类样品COI 基因的扩增条带Fig.1 Amplifi cation of COⅠ gene sequences from different commercial fi sh products

本研究设计的引物扩增目标片段约为750 bp，经1%琼脂糖凝胶电泳检测的PCR扩增产物分子质量与设计相符（图1）。将DNA片段纯化后送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，所有77 份获得测序序列，且经过序列比对后相似度均在98%以上，说明DNA条形码技术可以精准地对各种冻鱼、鱼片以及鱼柳样品进行鉴定。

2.3 标签符合性分析

表1 批发市场样品鉴定结果Table1 Identifi cation results of fi sh products obtained from wholesalers

批发市场购买的59 份样品，经基因测序后其序列与NCBI数据库比对分析后的相似度汇总于表1。结果表明，有20 份存在标签贴错的混乱现象，误贴率为33.9%，其中大多数是由于卖家没有专业的分类知识所致。除了金线鱼（Nemipterus virgatus）标为“黄花鱼”（序号31）、蛇鲻（Saurida elongata）标为“九江鱼”（序号41）这2 份样品存在严重的错标外，其他错标可能是由于鱼的外形不易辨别而导致的商品错标。如众多标有“池鱼”的商品是花腹鲭（Scomber australasicus）和日本鲭（Scomber japonicus）2 种不同的鱼；标有金线鱼、“红衫鱼”和“红三鱼”的多属于同一种鱼；史氏低鳍鲳（Peprilus snyderi）在形态学上和南鲳（Psenopsis anomala）比较相似；长尾大眼鲷（Priacanthus tayenus）也经常被渔民当作“红衫鱼”。红尾圆鲹（Decapterus akaadsi）与花腹鲭和日本鲭虽然在种属差别很大，但是形态上都是长梭形，比较容易被商贩误以为是“池鱼”。

表2 超市样品鉴定结果Table2 Identifi cation results of fi sh samples obtained from supermarket

超市购买的18 份鱼片和鱼柳样品经基因测序，其序列与NCBI数据库比对分析后的相似度汇总于表2。其中，超过1/3的样品存在以价格较低的鱼标成价格较高的鱼的现象。“龙俐鱼”一般指舌鳎科舌鳎属的几种鱼类，如半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）；然而此次调查所有标有“龙俐鱼”的商品竟然都是低价的“巴丁鱼”（Pangasianodon hypophthalmus）；而罗非鱼（Oreochromis niloticus）也被标为价格较高的“鲷鱼”；纯正鳕鱼一般为大西洋鳕鱼（Gadus morhua）、格陵兰鳕鱼（Gadus ogac）和太平洋鳕鱼（Gadus macrocephalus）3 种，虽然细鳞壮鳕（Albatrossiapectoralis）不能被当作传统意义上的鳕鱼，也勉强可以叫鳕鱼，然而一些商家竟然将马舌鲽鱼（Reinhardtius hippoglossoides）标为“鳕鱼片”；“白鲳”在一些地方也被标为金鲳即卵形鲳鲹（Trachinotus ovatu）。

33 讨 论

3.1 市场错贴标签的种类

各种因素都可能造成商品错标现象。1）渔民由于缺乏专业的分类学知识导致鱼从刚捕捞上来就被贴错标签[7]，这种情况主要由于鱼的形态比较相似导致，在此次调查中这类现象普遍存在，如花腹鲭、日本鲭以及红尾圆鲹被标为“池鱼”，而金线鱼则被标上“金线鱼”、“红衫鱼”和“红三鱼”等多种商标。2）有些鱼的形态相差甚远，但鱼肉无法区分，使得一些价格较低的鱼可能被标成价格较高的鱼。这种行为不仅在国内时常发生，在欧美等众多发达国家也存在，一些渔业厂商甚至有意将低价鱼贴上名贵鱼肉的标签，以赚取更高利润[4,20-22]。本实验对收集的样品进行检测后发现，被误标鱼类多集中在高价值经济鱼类，如罗非鱼片代替“鲷鱼”，“巴丁鱼”代替“龙俐鱼”、“鮰鱼”，“鲽鱼”代替鳕鱼等。

此外，一些禁止销售的鱼类，也会发生贴错标签现象[23]。Birstein等[24]利用DNA条形码分析发现23%的鱼子酱标注的鱼类名称错误，部分商品涉及濒危鱼类成分；商贩也会把濒危和受保护的物种贴成市场可以销售的商品标签，例如Liu等[25]研究了台湾境内548 份鱼翅样品，结果显示有2.5%的鲨鱼物种是濒危，50%易危，24.5%近危，仅有23%的物种是非濒危物种的。错贴标签还可能导致一些鱼类引发的食物中毒[26]，我国沿海地区的一些餐馆会把许多有毒的河豚当作无毒的河豚贩卖，最后导致悲剧的发生[1]；此次尚未检测到濒危物种和禁止销售的鱼类。

3.2 鱼肉真伪鉴别方法

通常人们在买鱼时对鱼肉好坏的鉴别方法主要是凭借感觉、经验以及喜好程度进行评判，但是这样不能有效地分辨鱼的种类。研究[27-28]表明，通过近红外光谱法可对鱼糜中水分和蛋白质含量进行快速、无损检测。Mounier等[29]研究发现，变性高效液相色谱是一种快速、有效的肉类成分鉴定技术，可判断鱼糜及蟹棒中成分组成。酶联免疫吸附测定法也被广泛应用到果汁饮料、奶类产品和动物源性成分的检测和鉴别，并且具有高灵敏度和特异性[30]。等电聚焦法和双向电泳法可以对不同种类冷冻虾、鲈鱼进行鉴定[31-32]。

随着分子生物技术的快速发展，近年来DNA鉴别法越来越常见，限制性片段长度多态性PCR（PCR-restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术可以对肉类制品进行正确鉴别[33-35]，如Hsieh等[34]利用PCR-RFLP技术可以对热处理（121 ℃，10～90 min）的河豚鱼制品进行正确鉴别。扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）分子标记技术鉴别鱼肉品种早有报道，如Zhang Junbin等[36]采用AFLP和变性梯度电泳鉴别虹鳟鱼和大西洋鲑鱼，结果表明AFLP具有更高的灵敏度，可以对鲑鱼进行准确鉴定。Maldini等[37]研究表明，AFLP分子标记技术可以用于32 种冷冻鱼类和家畜品种的准确鉴别，也可以用于热处理海产品的鉴别。最近几年来，DNA条形码技术也已被越来越多应用到食品鉴定中[7-11,16-18,23-25,38]。

3.3 DNA条形码技术的优势

与传统形态鉴定相比较，DNA条形码技术具有诸多优势：鉴定不依赖形态特征，不受个体差异的影响，能够鉴定到种的水平[39-40]，对实验人员的操作技能要求低等特点。使得物种鉴定过程变得简单、有效和统一。与一般的蛋白质鉴定方法相比，由于DNA比蛋白质的耐热性强，但是通过优化手段仍然可以从加工产品中提取小片段的DNA[41]；DNA本身的复杂性也可以能提供更多信息；而且DNA条形码技术不受组织类型、年龄及状态等因素的影响。因此，该技术具有更高的特异性、灵敏度和可靠性。

与其他DNA鉴别方法比较，DNA条形码技术具有操作简单、可靠快捷以及应用广泛等优势。PCR-RFLP在物种鉴定中已成为一个重要的方法，但由于物种的种内变异可能导致在鉴定过程中出现误判；AFLP虽然相对可靠、操作简便，但AFLP也会发生谱带错配或缺失，而且其成本也比DNA条形码技术高[42]；微卫星标记的等位基因数目多、带型复杂，从而导致难以判型，给DNA指纹识别自动化和规模化带来困难[43]。

3.4 展望

尽管DNA条形码技术具有许多优势，然而，在食物鉴定方面还存在一些挑战。在食物加工过程中往往会因为高温等导致DNA降解，以及植物油、添加剂和调味料的加入对DNA提取和扩增有很大影响，这就需要对一些步骤进行各种优化；另外，一些鱼丸或肉丸可能不是来自单个物种，这就无法对食物种源进行准确鉴定。此外，由于食物的种类繁多，目前的DNA条形码数据库虽然物种量比较丰富但还远不够完善，因此，在用公共数据库进行比对分析时可能存在一些困难。

目前，我国对DNA条形码技术的应用主要集中在分类学和物种鉴定研究中[12-15]，在应用领域处于刚刚起步的阶段。今后，DNA条形码技术在进出口物种鉴定、外来入侵物种监管和食品鉴定等方面将会发挥越来越重要的作用。

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Identifying Fish Products in Shenzhen through DNA Barcoding

WANG Min1, LIU Hong2, HUANG Hai3, ZHAO Xiaomeng1, SHI Qiong1, HE Shunping1,4, SUN Ying1,*
(1. BGI-Shenzhen, Shenzhen 518083, China; 2. Animal & Plant Inspection and Quarantine Technology Center, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, S henzhen 518045, China; 3. Sanya Science and Technology Academy for Crop Winter Multiplication, Sanya 572000, China; 4. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

In this study, DNA barcoding was applied to identify the exact species of fi sh products from Shenzhen wholesale and retail markets and to check if these products are correctly labeled. Using mitochondrial cytochrome C oxidase subunitⅠ (COⅠ) gene as the target, the sequences of COⅠ from different samples were analyzed. Our results showed that the COⅠgene sequences of all 77 samples examined were successfully amplifi ed by PCR. Howe ver, up to 36.36%（28/77）of them were inconsistent with their label descriptions, in which all the products labeled with “tongue fi sh” were actually the low-cost Pangasian odon hypophthalmus. As a simple, rapid and effi cient technology, DNA barcoding can be widely used for species identifi cation of fi sh products.

DNA barcoding; mitochondrial cytochrome C oxidase subunit Ⅰ (COⅠ) gene; species identifi cation; fi sh products

Q95

B

1002-6630（2015）20-0247-05

10.7506/spkx1002-6630-201520048

2015-01-29

深圳市科技计划深港创新圈项目（SGLH20131010105856414）；广东省省部产学研专项（2013B090800017）

王敏（1988—），男，硕士，研究方向为水生生物学。E-mail：wangmin2@genomics.cn

*通信作者：孙颖（1972—），女，副研究员，博士，研究方向为鱼类生物学。E-mail：yingsun09@163.com