高密度固态培养产朊假丝酵母菌剂的工艺优化

徐 速 孙立斌 杨海明 孙 慧 江连洲（.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 50030；.黑龙江省轻工科学研究院，黑龙江 哈尔滨 5000）

益生菌是指有益于宿主健康的微生物活菌制剂［1］。随着抗生素滥用和残留问题的出现，益生菌剂的研究受到学术界广泛关注。已有众多实例证明，益生菌能刺激宿主肠道内生有益菌群平衡，抑制肠道中腐败菌生长［2］，促进肠道中有害物质的降解与转化，调节宿主免疫力，增加抗病能力［3，4］，从而提高动物的生产能力和增加养殖动物的经济效益。

产朊假丝酵母是被广泛公认的畜禽动物益生菌，早在1989年就已被美国FDA（美国食品和药品管理局）和AAFCC（美国饲料官方协会）批准为可直接饲喂动物的安全菌株，2008年中国农业部也将其列入允许饲喂的菌种目录［1］。酵母发酵饲料含有丰富的蛋白、小肽及氨基酸，增加饲料的营养价值［4］；产阮假丝酵母菌体所含蛋白质和维生素B含量均较高，且生长所需营养物质更简单、可利用许多工农业副产物做原料生长繁殖［5，6］，菌体代谢后常常散发出宜人的香气，可增加动物摄食欲望、提高生产能力。

中国每年加工大米、豆油、玉米后剩余大量副产物稻壳、豆粕、秸秆等，其中豆粕常用作替代玉米直接饲喂动物，原料利用率较低［6］；而秸秆、稻壳常常被农民废弃或焚烧，浪费资源污染环境。J.Y.Choi等［4］研究了液态发酵益生菌剂和固态发酵益生菌剂对断奶仔猪的影响，发现在提高生产性能和肠道有益微生物菌群、降低肠道有害微生物菌群方面，固态发酵优于液态发酵。固态发酵所制益生菌更利于益生菌的保存和活性的稳定，实际应用价值则更大。目前中国因生产麸皮的企业均在河南、河北、山东、山西等地，故在东北地区利用麸皮生产饲料酵母成本较高，而以秸秆稻壳替代麸皮固态发酵制备酵母菌还未见报道。本研究拟通过正交试验、中心组合试验设计及响应面分析法优化培养条件及培养基成分，为豆粕秸秆稻壳混合制备酵母益生菌剂提供基础数据。同时，也对解决人畜争粮矛盾、减少环境污染、改善农业生态环境具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

产阮假丝酵母2.118：黑龙江省应用微生物研究所菌种保藏中心；

酵母种子培养基：PDA液体培养基，121℃灭菌20min；

酵母菌种子液：将已活化的酵母菌斜面菌体一菌环接入PDA液体种子培养基，30℃摇床180r/min培养16h；

1.2 材料

稻壳、豆粕：购自饲料市场，豆粕粉碎过40目备用；

秸秆：取自哈市农户自然干燥贮存，粉碎平均长度1～3 mm。

1.3 试剂与仪器

NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4：分析纯，天津天力化学有限公司；

粉碎机：HR2168型，珠海飞利浦家庭电器有限公司；

恒温水浴锅：DK－98－1型，天津泰斯特仪器有限公司；

生化培养箱：LRH－250型，上海一恒科技有限公司；

特大容量恒温振荡器：TDHZ－2002B型，太仓市华美生化仪器厂；

超净工作台：ZHJH－1109型，深圳市朗普电子科技有限公司；

高压灭菌锅：XYRX－20型，浙江新丰医疗器械有限公司；

电热干燥箱：DHG－9240A型，上海精宏实验设备有限公司；

真空干燥箱：DZF6090型，上海精宏实验设备有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微量元素溶液的制备

（1）1×微量元素溶液（m/V）：准确称取分析纯 NaNO30.6g、K2HPO40.2g、KCl 0.1g、MgSO4·7H2O 0.1g、Fe－SO40.002g，分别用少量蒸馏水溶解、合并后定容至100 mL，即得 NaNO30.6%、K2HPO40.2%、KCl 0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%，FeSO40.002%的1×微量元素溶液，备用。

（2）2×微量元素溶液（m/V）：NaNO31.2%、K2HPO40.4%、KCl 0.2%、MgSO4·7H2O 0.2%，FeSO40.004%；3×微量元素溶液（m/V）：NaNO31.8%、K2HPO40.6%、KCl 0.3%、MgSO4·7H2O 0.3%，FeSO40.006%。制备方法同1.4.1（1）。

1.4.2 秸秆添加量对酵母菌生长的影响 固定每份原料总量40g，分别将豆粕∶稻壳∶秸秆按5∶2∶1，5∶2∶2，5∶2∶3，5∶2∶4，5∶2∶5比例混匀，再分别向每份原料添加50mL水及1×微量元素溶液，葡萄糖1g，在容器中混匀封口，121℃灭菌15min，冷却，接种，铺成2cm厚度，30℃培养24h，取样，用血球计数器测定酵母菌数。每个样品重复3次取平均值。

1.4.3 稻壳添加比例对菌体数目的影响 固定每份原料总量40g，分别将豆粕∶秸秆∶稻壳按5∶2∶1，5∶2∶2，5∶2∶3，5∶2∶4，5∶2∶5比例混匀，再分别向每份原料添加50mL水及1×微量元素溶液，1g葡萄糖，在容器中混匀封口，余下步骤同1.4.2。

1.4.4 碳源对酵母菌生长的影响 取原料豆粕、秸秆和稻壳按5∶2∶2混匀，每份40g，依次加入葡萄糖1，2，3，4，5 g，再分别向每份原料添加50mL水及1×微量元素溶液，混匀，余下步骤同1.4.2。

1.4.5 氮源对酵母菌生长的影响 取原料豆粕、秸秆和稻壳按5∶2∶2混匀，每份40g，向每份原料中依次加入硫酸铵0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g，或 尿 素 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g；再分别向每份原料加入50mL水及1×微量元素溶液，1g葡萄糖，余下步骤同1.4.2。

1.4.6 固态培养产朊假丝酵母活菌剂的生长曲线 取原料豆粕、秸秆和稻壳按5∶2∶2混匀，每份40g，分别向每份原料加入50mL水及1×微量元素，在容器中混匀封口，121℃灭菌15min，接种，铺成2cm厚度，30℃培养12h后每隔2 h取样，用血球计数器测定酵母菌数。每个样品重复3次取平均值。

1.4.7 正交试验确定最佳培养基成分 在碳源、氮源单因素试验基础上，对培养基成分中影响酵母菌生长数量的因素葡萄糖、硫酸铵、微量元素营养液添加倍数进行三因素三水平正交试验，以确定最佳培养基成分配比。

1.4.8 中心组合试验设计优化酵母菌固体培养条件 利用Design－Expert 7.0软件，采用中心组合设计试验方案建立关于接种量、固体培养基厚度、水分添加量和培养温度四因素变量的二次回归模型，以确定最佳培养条件，试验设计因素水平见表1。选取接种量、厚度、水分添加量和发酵温度4个因素为自变量，以酵母菌的菌数为响应值，以前期单因素试验最佳结果为中心点，根据中心组合设计原理设计试验。取5种水平自变量编码，中心点试验重复试验数为6，试验重复3次取平均值，每组试验原料用量40g。

表1 中心组合试验设计因素水平编码表Table 1 Levels of independent variables of simplex－centroid design

1.4.9 酵母菌剂的干制 将最佳培养的酵母菌剂40℃真空干燥8h或常压45℃干燥24h后，平板计数测定酵母菌活菌数。重复3次取平均值。

2 结果与分析

2.1 秸秆添加比例对酵母菌生长的影响

在实际操作中，豆粕灭菌后黏度增大，容易结块，不利于氧气的传质。秸秆主要含纤维素、半纤维素、木质素等不易被酵母菌利用的成分，基质中添加适当比例的秸秆既起到机械支撑作用，又可增加培养基通透性和通气量，利于氧气的流通和酵母的增殖。由图1可知，虽然随着原料中秸秆比例的增加，酵母菌活菌数呈现下降趋势，但当秸秆比例从1/8增加到4/11时，酵母菌对数值从8.4降到8.1，活菌数从2.6×108g－1降低到1.4×108g－1，仍保持在同一数量级，说明秸秆比例增加对酵母活菌数下降并不成正比，其影响趋势较平缓。结合原料成本与活菌数量综合考虑，选择豆粕∶稻壳∶秸秆＝5∶2∶2较适宜。

图1 秸秆添加量对酵母菌生长的影响Figure 1 Effects of corn straw on the growth of yeast

2.2 稻壳添加比例对菌种的影响

据资料［7］报道，稻壳含有大量纤维素、木质素、二氧化硅及少量的蛋白质和钙磷元素，如不经处理，应用于饲料将影响动物的消化吸收率。虽然稻壳可利用的营养成分较贫乏，但试验中发现稻壳具有良好的多孔性和吸水性，可作为固态发酵营养物质良好的载体，为固态发酵培养基提供良好的通气性和保湿性。同时试验中还观察到，培养结束时培养基表观湿度增大，分析可能是通过酵母菌的生长代谢产生了水分，增加了湿度所致。推测这将软化稻壳中纤维素等成分，释放更多的可溶性物质，增加培养基中菌体数目，从而增加菌体蛋白含量。由图2可知，随着稻壳添加量的增大，酵母菌的生长数量呈现先增加、后降低、然后趋于平稳的走势，即添加比例（豆粕∶秸秆∶稻壳）从5∶2∶1至5∶2∶2时，酵母菌对数从8.37增加到8.47，酵母菌数量从2.3×108g－1增加至3×108g－1；当增至5∶2∶3以上时，酵母菌对数在8.25～8.33，酵母数保持在1.8×108～2.15×108g－1。综合考虑，选择豆粕∶稻壳∶秸秆＝5∶2∶2较为适宜。

2.3 碳源对酵母菌生长的影响

葡萄糖是酵母菌可以直接利用的碳源，在酵母生长代谢中既作为酵母菌细胞骨架，又作为代谢的能源物质。随着市场上淀粉糖生产技术的提高，葡萄糖价格不断下降，可作为酵母菌生长的辅助碳源。由图3可知，在原料比例一定的条件下，起初酵母菌的数量随着葡萄糖量的增加而增加，当葡萄糖增加到4g时，酵母菌生长数量达到最高，葡萄糖的添加量继续增高时，酵母菌数量开始下降。推测可能是随着葡萄糖添加量增加，酵母菌生长外环境碳源浓度的增大，导致酵母生长的外环境产生更高的渗透压，影响酵母菌细胞代谢的进行，致使酵母菌生长速率减缓，数量下降。因此，选择添加葡萄糖4g。

图2 稻壳添加量对酵母菌生长的影响Figure 2 Effects of rice hull on the growth of yeast

图3 葡萄糖对酵母菌生长的影响Figure 3 Effects of glucose on the growth of yeast

2.4 氮源对酵母菌生长的影响

尿素、硫酸铵、蛋白胨是常用的氮源，因蛋白胨的价格较高，而本试验的目的是通过最小的花费获得最大的酵母菌数量，所以选用尿素和硫酸铵做外加的氮源。由图4可知，添加硫酸铵的效果为先扬后平，最佳添加量为0.4g，酵母菌最大数量4.25×108g－1。而添加尿素的效果为先扬后抑，最佳添加量为0.8g，酵母菌最大数量4.0×108g－1。目前市场上尿素的价格远高于硫酸铵价格，且尿素添加量大于硫酸铵用量，不论是从经济角度还是实际效果来看，选择硫酸铵添加量0.4g更适宜。

2.5 固态培养酵母菌剂的生长曲线

图4 氮源对酵母菌生长的影响Figure 4 Effects of inorganic nitrogen on the growth of yeast

图5 酵母菌固态培养生长曲线Figure 5 The growth curve of yeast through solid－state ferment

由图5可知，当取发酵12h样品检测时，酵母菌开始进入对数生长期。当发酵时间大于28h以后，培养基中的营养成分逐渐消耗，酵母菌的生长达到平稳期。为了生产更多的酵母菌，选择26～28h终止发酵为宜。

2.6 正交试验优化培养基成分结果分析

在单因素试验基础上，通过碳源、氮源和微量元素三因素正交试验进一步优化培养基成分比例，正交试验因素水平取值见表2，结果见表3。通过极差分析可知，对酵母菌生长影响因素从大到小依次为葡萄糖＞微量元素＞硫酸铵。

为了检验直观分析中各因素不同水平差异是否显著，进一步采用SPSS17.0对上述影响因素进行单因素方差分析即Tukey HSD多重比较，结果显示葡萄糖水平1与水平3差异不显著，但二者均与水平2差异极显著，硫酸铵和微量元素各水平俩俩之间差异均不显著，故选择葡萄糖添加量4g、硫酸铵0.2g和微量元素1倍浓度，即A2B1CI为宜。将理论获得的A2B1CI组合重复3次实验，酵母菌数平均值（8.10±0.07）×108g－1，验证了所得组合稳定可靠。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Levels of different variables of orthogonal experiments

表3 正交试验结果与分析Table 3 The results and analyses of orthogonal experiment

2.7 中心组合试验设计优化酵母菌培养条件

2.7.1 中心组合试验设计及结果分析 按照1.4.8进行中心组合试验优化酵母培养条件，结果见表4。

通过Design－expert 7.0对试验数据进行回归数据分析，建立二次回归模型：

对模型数据进行方差分析，结果见表5。

由表5可知，回归模型的F值55.85，“Prob＞F值”＜0.000 1，说明自变量与响应值的回归关系显著；失拟项的F值为2.24、“Prob＞F值”0.193 4，说明失拟项与纯误差差异不显著。该模型的决定系数R2为0.981 2，调整后的决定系数为0.963 6，变异系数5.29%。决定系数介于0至1之间，决定系数越大，说明拟合方程的参考价值越大，模型拟合度越好；变异系数越小表示试验可信度越高［8］。综上可知，所建模型拟合度良好，可以理论推测因自变量变化而对响应值的影响。

由表5中F值可知，自变量因子贡献率为D＞A＞B＞C，即培养温度＞接种量＞厚度＞水分添加量，即培养温度对菌种生长的影响最为显著，接种量与厚度次之，水分添加量相对影响较小。模型中自变量之间的交互作用对响应值影响明显的有AB（接种量与厚度）、AC（接种量与水分）、BC（厚度与水分）、CD（水分与温度），其3D响应面交互作用见图6～9。图6～9中的酵母菌数量均随着接种量、厚度、水分、发酵温度呈现不同程度的先增加后降低趋势。固态培养中酵母菌数的增长除了与营养成分相关外，还受氧气、水分、温度、初始菌种数量影响。酵母菌是好氧微生物，增殖需要足够的氧气，培养基厚度过大将影响氧的供应。酵母生长代谢需要一定的水分活度，水分含量越高，水分活度越大，酵母菌越易生长，但过多的水分会粘结固态培养基原料，导致氧气传质受阻，影响酵母菌生长繁殖。酵母菌生长有其最适温度，在最适温度前，随着温度升高，酵母菌生长加快，但当超过最适温度时，则影响到酵母菌自身代谢而呈下降趋势。从图6～9可以看出，图中两两因素均存在交互作用，但A（接种量）与C（水分）图形最陡，交互作用最明显。

表4 中心组合试验设计及结果Table 4 Simplex－centroid design and response values

表5 中心组合试验方差分析表Table 5 ANOVA for the reduced quadratic mixture models

图6 接种量A与厚度B交互作用响应面三维图示Figure 6 Combined effects of inoculum size A and thickness B on yeast count

通过Design－Expert 7.0软件优化功能，得到模型的最优工艺参数和预测值：接种量3.51%，厚度1.29cm，水分36.53mL，温度30.58℃，酵母菌数理论预测值1.227×109g－1。结合实际情况，最终优化参数为接种量3.50%，厚度1.3cm，水分添加量∶原料＝1∶1（m∶m），温度30.6℃。

2.7.2 验证实验 在最佳培养条件下，重复5次固体培养，平板涂布计数酵母菌数量分别为1.23×109，1.35×109，1.10×109，1.40×109，1.25×109CFU/g，平均值为（1.27±0.12）×109CFU/g，与模型预测值1.23×109CFU/g接近，说明模型拟合性较好，可以用来理论预测培养的酵母活菌数值，该模型真实有效。

图7 接种量A与水分添加量C交互作用响应面三维图示Figure 7 Combined effects of inoculum size A and water addition C on yeast count

图8 厚度B与水分添加量C交互作用响应面三维图示Figure 8 Combined effects of thickness B and water addition C on yeast count

图9 水分添加量C与温度D交互作用响应面三维图示Figure 9 Combined effects of water addition C and temperature D on yeast count

2.8 酵母菌剂的干制

按最佳方法固态培养28h酵母菌数折合绝干料均值（2.92±0.05）×109CFU/g。经真空40 ℃干燥8h后测得酵母菌活菌数折合绝干料（2.34±0.03）×109CFU/g，存活率80%。常压45℃干燥24h后测得酵母菌活菌数折合绝干料（1.90±0.03）×109CFU/g，存活率65%。

3 结论

本试验开展了以秸秆稻壳替代麸皮固态培养产朊假丝酵母的研究，利用产朊假丝酵母生长条件相对简单的特点［9］，采用中心组合试验设计及响应面分析法优化了酵母菌培养条件，发酵28h，酵母活菌计数（2.92±0.05）×109CFU/g绝干，试验结果表明以秸秆稻壳替代麸皮固态培养产朊假丝酵母效果良好。

目前，以豆粕、麸皮为原料，利用酵母菌或复合菌种固态发酵提高原料蛋白含量的研究居多，而利用豆粕为主要原料制备活性酵母菌剂的报道较少。杨世平等［10］利用豆粕、麸皮、红糖、酵母膏等培养沼泽生红冬孢酵母，虽然所获酵母活菌数较高，但成本偏高，发酵时间偏长。相比之下，本试验更注重低成本和短时间，且原料更切合北方实际，具有潜在的应用价值。本试验常压干制，适合中小企业的应用；真空干燥，更适宜投资大的企业应用。

Mitchell等［11］认为固态发酵中存在传热传质的问题，为此，在小试基础上扩大生产应进一步摸索参数，可通过改善通风等因素，进一步提高供氧能力，以提升酵母活菌数量，摊薄生产成本，制备高效廉价的酵母益生菌剂。

1 胡学智，王俊.益生菌饲料的现状、生产和应用效果［J］.中国微生态学杂志，2011，23（9）：861～864.

2 Melanie Le Bon，Helen E Davies，Caitriona Glynn，et al.Influence of probiotics on gut health in the weaned pig［J］.Livestock Science，2010（133）：179～181.

3 Francesca Gaggìa，Paola Mattarelli，Bruno Biavati.Probiotics and prebiotics in animal feeding for safe food production［J］.International Journal of Food Microbiology，2010（141）：S15～S28.

4 Choi J Y，Shinde P L，Ingale S L，et al.Evaluation of multi－microbe probiotics prepared by submerged liquid or solid substrate fermentation and antibiotics in weaning pigs［J］.Livestock Science，2011（138）：144～151.

5 M Ibrahim Rajoka，Sohail Hassan Khan，M A Jabbar，et al.Kinetics of batch single cell protein production from rice polishings withCandida utilisin continuously aerated tank reactors［J］.Bioresource Technology，2006（97）：1 934～1 941.

6 李永凯，毛胜勇，朱伟云.益生菌发酵饲料研究及应用现状［J］.畜牧与兽医，2009，41（3）：90～92.

7 陈洪章，徐建.现代固态发酵原理与应用［M］.北京：化学工业出版社，2004：38.

8 陶发琴，王明鹏，王卫星，等.响应面法优化酵母油脂的提取工艺［J］.中国粮油学报，2013，28（4）：51～58.

9 Guo Hong－wei，Chang Juan，Yin Qing－qiang，et al.Effect of the combined physical and chemical treatments with microbial fermentation on corn straw degradation［J］.Bioresource Technology，2013（148）：361～365.

10 杨世平，刘慧玲，刘付文.沼泽生红冬孢酵母的固体培养条件［J］.广东海洋大学学报，2013，33（3）：22～26.

11 Gélinas P，Barrette J.Protein enrichment of potato processing waste through yeast fermentation［J］.Bioresource Technology，2007（98）：1 138～1 143.