超声波辅助提取野桂花蜜中多酚的工艺优化

王 雨 单 杨 李高阳

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省农科院，湖南 长沙 410125；3.湖南省农产品加工研究所，湖南 长沙 410125）

野桂花蜜中的酚类化合物是一种天然的抗氧化剂［1］。天然抗氧化剂具有无毒害的特点，可以有效地抑制人体内的自由基［2－5］。目前对蜂蜜多酚的提取多采用传统的浸提法或是直接粗略萃取后进行纯化，存在提取时间长、提取率低的问题。

超声波辅助提取法由于操作简便，提取效率高等优点，已广泛应用于天然产物中有效成分的提取［6－8］。超声波能产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，可以高效地提取天然活性成分［9］。本研究拟以野桂花蜜为原料，采用超声波辅助提取野桂花蜜中的多酚化合物，再用响应面优化提取工艺参数，从而为获得更高得率的多酚化合物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野桂花蜜：产自洞庭湖畔，低温保存，湖南省明园蜂业有限公司；

Folin－酚试剂：上海安谱科学仪器有限公司；

原儿茶酸标准品：美国Sigma公司；

乙酸乙酯、盐酸、碳酸钠：分析纯，上海试剂公司。

1.2 仪器与设备

电子天平：AUW220D型，日本岛津有限公司；

超声波清洗器：KQ－500DTV型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

紫外－可见分光光度计：UV－1700型，日本岛津有限公司；

旋转蒸发仪：EV311型，上海垣钦自动化科技有限公司；

循环水真空泵：SHZ－III型，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 原儿茶酸标准曲线的制作 配制浓度为0.1mg/mL的原儿茶酸标准溶液，分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于10mL的容量瓶中，加入福林—酚试剂1mL，用玻璃棒搅匀，然后加入1mol/L的碳酸钠溶液5mL，定容摇匀，常温下避光静置1h，于765nm处测吸光度。以原儿茶酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归分析，得到的回归方程为y＝150.71x＋0.004 3（R2＝0.999 8）。

1.3.2 野桂花蜜多酚化合物的超声波辅助提取 准确称量10.0g野桂花蜜于50mL的锥形瓶中，将一定溶剂浓度的乙酸乙酯溶液，按照不同料液比加入锥形瓶中，磁力搅拌1min后，将锥形瓶置于超声波发生器中一定温度下提取一段时间后，趁热分离合并上清液。然后真空浓缩至膏状物，用4mL乙醇溶解，在765nm下测定吸光度。

1.3.3 多酚化合物得率的测定 多酚化合物得率按式（1）计算：

式中：

Y——多酚得率，mg/10g；

C——测得的多酚浓度，mg/mL；

V——乙醇溶液体积，mL；

M0——原料的质量，g。

1.3.4 单因素试验设计

（1）溶剂浓度对多酚得率的影响：固定料液比为1︰10（m︰V），超声波时间为20min，超声波温度为50℃，考察不同溶剂浓 度（30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%）对野桂花蜜多酚得率的影响。

（2）料液比对多酚得率的影响：固定溶剂浓度为60%，超声波时间为20min，超声波温度为50℃，考察不同料液比（1︰4，1︰6，1︰8，1︰10，1︰12，1︰14，m︰V）对野桂花蜜多酚得率的影响。

（3）超声波时间对多酚得率的影响：固定溶剂浓度为60%，料液比为1︰10（m︰V），超声波温度为50℃，考察不同超声波时间（10，15，20，25，30min）内野桂花蜜多酚得率的变化规律。

（4）超声波温度对多酚得率的影响：固定溶剂浓度为60%，料液比为1︰10（m︰V），超声波时间为20min，考察不同超声波温度（30，40，50，60，70℃）对野桂花蜜多酚得率的影响。

1.3.5 响应面优化试验 在单因素试验结果的基础上，根据Box－Behnken试验设计原理，以野桂花蜜多酚提取得率为响应值，选取溶剂浓度、料液比、超声波时间、超声波温度4个影响因素，设计四因素三水平的响应面优化试验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 溶剂浓度对多酚得率的影响Figure 1 Effect of concentration of solvent on yield of phenolic

2.1.1 溶剂浓度对野桂花蜜多酚得率的影响 由图1可知，溶剂浓度在60%以前，野桂花蜜多酚的得率随着溶剂浓度的增高而增多。当溶剂浓度到达60%之后，野桂花蜜多酚的得率呈现缓慢的下降趋势。溶剂浓度到达90%时，野桂花蜜多酚的得率降低至56.80mg/10g。这是因为开始时随着溶剂浓度的增高，野桂花蜜中多酚化合物与提取溶液的接触机会越来越多。当浓度到达60%之后，水分占比减少，野桂花蜜中的大分子糖类由于极性差异不能溶出，使得提取时有结晶未溶的现象。这使得其中的多酚没能充分溶解出来，提取量反而减少。所以，选择最佳的溶剂浓度为60%。

2.1.2 料液比对野桂花蜜多酚得率的影响 由图2可知，随着料液比的减少，野桂花蜜多酚的得率逐渐升高，当料液比达到1︰10（m︰V）时，野桂花蜜多酚的得率不再上升。其原因是随着溶剂的增加，多酚化合物更易接触到提取溶剂，多酚得率也就越大。当料液比达到1︰10（m︰V）时，多酚化合物已基本被提取出来，继续加入溶剂，起不到提高提取率的作用，高用量的溶剂反而不适于提取，同时，出于节约成本考虑，料液比选择1︰10（m︰V）为宜。

2.1.3 超声波时间对野桂花蜜多酚的影响 由图3可知，在20min内，野桂花蜜多酚得率随超声波时间的增加而增加，20min后，野桂花蜜多酚得率随超声波时间的增加反而出现下降。0～20min的过程中，由于超声波的空化作用，其提取速度得到提升，野桂花蜜多酚得率提升显著［10］。在20 min后，多酚化合物基本被提取出来，同时，由于过长的超声波作用，使得多酚化合物中一些不稳定的成分被破环［11］，所以出现了下降。故确定提取过程的最佳超声波时间为20 min。

图2 料液比对多酚得率的影响Figure 2 Effect of rate of solid to solution on yield of phenolic

图3 超声波时间对多酚得率的影响Figure 3 Effect of ultrasonic time on yield of phenolic

2.1.4 超声波温度对野桂花蜜多酚的影响 由图4可知，在温度低于50℃时，随着温度的升高，分子热运动加剧，使得多酚化合物的得率迅速提升，在50℃继续往上升温时，发现野桂花蜜多酚的得率随温度的上升有明显的下降。原因可能是多酚化合物中的热不稳定结构在高温作用下被破坏［12］。而且过高的温度会促进水分和乙酸乙酯的挥发，从而影响多酚得率。故选择最佳提取温度为50℃。

图4 超声波温度对多酚得率的影响Figure 4 Effect of ultrasonic temperature on yield of phenolic

2.2 响应面法优化提取条件

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据Box－Behnken中心组合试验设计原理［13］，结合单因素试验结果，设计四因素三水平的响应面分析试验，设计方案见表1，响应面优化试验结果见表2。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of respnse suirface analysis

表2 Box－Behnken设计方案及野桂花蜜多酚得率的测定结果Table 2 Box－Behnken matrix and respenses values of phenolic compounds yield

通过Design Expert V8.0.6软件对表2中的野桂花蜜多酚得率进行响应面回归分析，得到回归方程：

对回归方程进行方差分析（见表3），此回归模型显著（P＜0.000 1），而且上述回归方程的决定系数R2＝0.969 5，＝0.939 1，说明96.95%的数据可以用此方程模型解释，模型可以真实地反应各个因子与响应值之间的关系。与此同时，失拟项P值为0.072 6＞0.05，失拟项不显著说明此回归方程拟合度很好，试验误差小。因此可以用该回归方程分析和预测试验结果。由表3可知，一次项X1、X3和X4均达到极显著水平，X2不显著，而二次项的影响均为显著，说明各因素对野桂花蜜多酚的影响并非简单的线性关系。

表3 试验结果的方差分析Table 3 Variance analysis for the experiment result

表3 试验结果的方差分析Table 3 Variance analysis for the experiment result

＊＊.P＜0.01，差异极显著；＊.P＜0.05，差异显著；R2＝0.969 5；＝0.939 1。

来源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 显著性X1 278.40 1 278.40 53.10 ＜0.000 1＊＊X2 21.87 1 21.87 4.17 0.060 4 X3 62.42 1 62.42 11.90 0.003 9 ＊＊X4 384.54 1 384.54 73.35 ＜0.000 1 ＊＊X1X2 34.86 1 34.86 6.65 0.021 8 ＊X1X3 60.21 1 60.21 11.48 0.004 4 ＊＊X1X4 2.32 1 2.32 0.44 0.516 2 X2X3 47.19 1 47.19 9.01 0.009 5 ＊＊X2X4 19.49 1 19.49 3.71 0.074 3 X3X4 8.73 1 8.73 1.66 0.217 7 X12 1 017.19 1 1 017.19 194.04 ＜0.000 1 ＊＊X22 267.98 1 267.98 51.12 ＜0.000 1 ＊＊X32 372.09 1 372.09 70.98 ＜0.000 1 ＊＊X42 434.17 1 434.17 82.82 ＜0.000 1 ＊＊模型 2 336.58 14 166.90 31.84 ＜0.000 1 ＊＊失拟值 67.72 10 6.77 4.78 0.072 6纯误差 5.67 4 1.42总和2 409.97 28

2.2.2 响应面分析 通过回归方程，固定其中一个因素在0水平，可以得到另两个因素之间的交互作用的响应面图（见图5）。从图5中可直观地看出响应面的优化区域和各个因素对野桂花蜜多酚得率的影响程度。结合回归方程以及表3的数据可知：超声波温度对多酚得率的影响最为显著，响应值变化最大，同时曲线较陡。而料液比对多酚得率的影响最小，响应值变化较小，同时曲面比较平滑。综合后可以得出对野桂花蜜多酚得率的影响程度从大到小的顺序依次为超声波温度＞溶剂浓度＞超声波时间＞料液比。

2.2.3 最佳工艺条件的验证 通过 Design Expert V8.0.6软件对响应值（多酚的得率）进行优化分析，得到最佳提取条件为 X1（62.45）、X2（1∶9.94）、X3（21.22）、X4（53.75），即溶剂浓度62.45%，料液比1︰9.94（m︰V），超声波时间21.22min，超声波温度53.75℃，野桂花蜜多酚得率的理论值为68.952mg/10g。为方便实际操作，取溶剂浓度62%，料液比1︰10（m︰V），超声波时间21min，超声波温度54℃，对提取野桂花蜜多酚工艺进行验证实验（n＝3），得到野桂花蜜多酚的平均得率为68.27mg/10g，达到了理论值的99%，说明采用响应面法优化提取工艺得到的条件参数可靠。2.2.4 超声波辅助提取法与传统浸提法的比较 由表4可知，传统浸提法得到的野桂花蜜多酚的平均得率仅为52.48mg/10g。而超声波辅助提取法提取野桂花蜜多酚的得率比传统浸提法得率高出23%，而且大大节省了提取时间。

图5 各因素交互作用对野桂花蜜多酚得率影响的响应面图Figure 5 Response surface plots for extraction yield of phenolic compounds from wild osmanthus－scented honey in function of the factors

表4 提取方法对野桂花蜜得率的影响Table 4 The effects different extraction methods on the yield of wild osmanthus－scented honey（n＝3）

3 结论

通过Design Expert V8.0.6软件，以溶剂浓度、料液比、超声波时间、超声波温度为自变量，野桂花蜜多酚的得率为响应值，运用响应面分析法对试验结果进行分析，得到的回归模型拟合度好，误差小，能够用回归模型对试验结果进行分析，有一定的应用价值。优化验证后得到的野桂花蜜多酚提取工艺条件为：溶剂浓度62%，料液比1︰10（m︰V），超声波时间21min，超声波温度54℃。野桂花蜜多酚的得率为68.27mg/10g。超声波辅助提取法比传统浸提法的多酚得率高出23%。野桂花蜜中的多酚化合物的得率，可能会受蜜源地环境影响，如气候和蜜源植物本身状况等，因此有待进行深入研究。

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