姜黄素对阿尔茨海默病细胞模型miRNA106a的影响

乔娜娜 王运良

1）潍坊医学院2011级神经病学研究生 潍坊 261053 2）解放军第148中心医院神经内科 淄博 255300

姜黄素对阿尔茨海默病细胞模型miRNA106a的影响

乔娜娜1）王运良2）

1）潍坊医学院2011级神经病学研究生 潍坊 261053 2）解放军第148中心医院神经内科 淄博 255300

目的 探讨阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）中姜黄素与miR-106a的关系。方法 将PC12细胞随机分为5组：正常对照组（PC12细胞组），模型组（PC12细胞与浓度为4μg／mL的Aβ1-42共培养24h），anti-miR-106a组（造模成功后转染anti-miR-106a），姜黄素组（造模成功后加姜黄素，终浓度为20μmol／L）、共同作用组（anti-miR-106a加入姜黄素）。RT-PCR检测miR-106a的含量；Western blotting检测APP的含量。结果 RT-PCR结果显示，与正常对照组相比，模型组和anti-miR-106a组miR-106a含量均明显降低（P＜0.05），而姜黄素组明显升高（P＜0.05）。Western blotting结果显示，与正常对照组相比，模型组（P＜0.05）和anti-miR-106a组（P＜0.01）APP明显增加，姜黄素组APP比模型组明显降低（P＜0.05）。结论 姜黄素可通过正性调节miR-106a而参与AD的治疗。

姜黄素；miR-106a；anti-miR-106a；阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（AD）是一种老年性神经变性疾病，病情进行性加重，主要表现病理为细胞外淀粉样沉积、神经纤维缠结和神经元缺失。Aβ（β-amyloid protein，Aβ）沉积被认为是AD的始发因素［1］。Aβ是经APP转化而来，APP是一种广泛存在于全身组织细胞、具有膜受体蛋白样的跨膜糖蛋白，表达增加会加重AD的发生。近年来微小RNA（microRNA，miRNA）对AD的作用引起人们的广泛关注而成为研究的热点。研究发现，miRNA106a［2］在AD患者含量降低约50％，且能够上调APP mRNA的表达，增加APP的产生，利于AD的发生。如果能减少转化为Aβ的APP的产生，在某些程度能够减少Aβ的产生和沉积，从而减缓AD的发生。

在AD治疗的过程中，发现酚性色素姜黄素可能对AD的治疗有帮助。姜黄素最初作为一种食物广泛用于印度等亚洲国家人们的生活中，流行病学研究发现在70～79岁的印度老年人AD的发病率较同龄欧美人低4.4倍。根据国内外报道，迄今为止临床及实验室应用姜黄素尚未发现明显的不良反应，因而与非甾体抗炎药和其他抗氧化药物相比，姜黄素有可能成为治疗AD的安全、有效的新举措之一。研究发现，姜黄素能抑制Aβ的产生，但这种抑制作用是否与miRNA106a降低相关还不清楚。基于以上原因，我们对姜黄素与miRNA106a的关系进行探讨，目的是探索姜黄素对AD的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 PC12细胞（肾上腺嗜铬细胞瘤细胞），由军事医学科学院惠赠。细胞在含5％胎牛血清、10％马血清的高糖DMEM培养基中培养，放在5％进行CO2、37℃的培养箱，隔天半量换液，当细胞融合度＞80％时接种传代。按2×105个／mL的密度接种在96孔板中，按5×104个／mL的密度接种在24孔板中，贴壁生长12h后观察细胞生长状态，以细胞圆形、贴壁较好，显微镜下细胞透亮度可的细胞为正常细胞，可以用于实验，随机（按随机数字表法）分为正常对照组、模型组、anti-miR-106a组、姜黄素组和共同作用组，每组6个复孔。

1.2 实验药物与试剂 Aβ1-42、姜黄素、DMSO溶液、2.5％胰酶、4％多聚甲醛、Lipofectamine 2000（Sigma公司）、DMEM、胎牛血清、马血清（GIBCO公司）、DAB显色液（北京索莱宝科技有限公司）、PCR试剂盒、CCK-8试剂（Invitrogen公司）、anti-miRNA106a（南京金思特科技有限公司）、APP抗体（北京中杉金桥）。

1.3 主要仪器 细胞培养箱（HSX-150，上海）、倒置显微镜（尼康Ti-E／U／S，日本）、多功能酶标仪（Berthold，德国）、离心机（CHRIST，德国）、凝胶成像系统（analytikjena，德国）、荧光定量PCR仪（Eppendorf公司，德国）。

1.4 细胞模型的建立 首先用无菌蒸馏水将粉末状的Aβ1-42溶解，配成5mg／mL，密封后-20℃保存。使用前用1×PBS稀释成1mg／mL，于37℃培养箱中孵育24h，使其变为聚集状态的Aβ1-42。然后用微量加样器加入Aβ1-42（终浓度为4μg／mL），继续培养24h。

1.5 分组及处理 正常对照组：PC12细胞正常培养；B模型组：加入Aβ1-42使终浓度为4μg／mL培养24h；anti-miR-106a组：Aβ1-42培养24h后按照Lipofectamine 2000说明书进行瞬时转染miRNA106a；姜黄素组：Aβ1-42培养24h后加入姜黄素（终浓度为20μmol／L）培养48h；共同作用组：姜黄素和anti-miR-106a同时作用与模型组。

1.6 观察指标

1.6.1 观察细胞生长状态：观察96孔板中PC12细胞，培养结束后放于倒置显微镜下观察细胞形态、数量。

1.6.2 RT-PCR检测miR-106a水平：检测24孔板中PC12细胞，培养结束后吸出培养基，利用RNA提取试剂盒一步法提取总RNA，建立荧光定量PCR反应体系，经过反转录、扩增后检测使用凝胶分析系统软件扫描，以各条带的灰度值／内参照灰度值的比值进mRNA表达的半定量分析。其中miR-106a上游引物序列CGGCAAAGTGCTAAC AGT，下游引物序列GTGCAGG GTCCGAGGT；U6内参上游引物序列ATTGGAACGATACAGAGAAG ATT，下游引物序列GGAACGCTTCA CGAATTTG。反应条件：95℃30min，92℃12s，62℃55s，40个循环，荧光定量RQ＝2-△△CT计算。1.6.3 Western blot方法检测APP水平：抽提PC12细胞，用RIPA裂解液（50mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS）在冰上裂解，离心取上清液即蛋白质，按照Western blot说明书进行，其中一抗为兔抗鼠APP，二抗为山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶抗体，应用LAS-4000型荧光／化学发光成像分析系统进行显像，通过计算APP与β-actin光密度的比值反映各组中APP的表达变化。

1.7 统计分析 计量资料数据以均数±标准差表示，应用SPSS 13.0统计软件，组间比较用方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。图表绘制由Excel2003统计软件完成。

2 结果

2.1 PC12细胞观察及活性检测 培养PC12细胞，接种12h后细胞贴壁良好，细胞圆形饱满，透光度好。加入已孵育好的终浓度为4μg／mL的Aβ1-42处理24h后，可见细胞数量减少、体积变小、贴壁性减弱，悬浮细胞较多；anti-miR-106a 组PC12细胞基本同模型组；姜黄素组中PC12细胞数量明显增加，形态饱满；共同作用组细胞数量介于姜黄素组合模型素组之间，部分细胞细胞膜出现皱缩。详见图1。

图1 各组中PC12细胞显微镜下观察

A（正常对照组）中细胞数量较多，贴壁较好，形态饱满；B（模型组）中细胞数量减少，体积减小，细胞膜出现皱缩；C（anti-miR-106a组）中细胞与模型组中差别不大；D（姜黄素组）中细胞数量较正常对照组稍多，形态相似；E（共同作用组）中细胞数量介于图片B、E中细胞数量之间，部分细胞出现细胞膜皱缩

2.2 各组PC12细胞miR-106a检测RT-PCR检测 各组中miR-106a，与正常对照组miR-106a相比，模型组和anti-miR-106a组均明显降低（P＜0.05），而姜黄素组明显升高（P＜0.01），共同作用组无明显差异（P＞0.05）。见图2。

图2 各组PC12细胞中miR-106a相对值

2.3 细胞APP水平检测 与正常对照组APP相比，模型组（P＜0.05）和anti-miR-106a组明显增加（P＜0.01），姜黄素组APP与模型组相比明显降低（P＜0.01），共同作用组与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 各组PC12细胞中APP相对值

3 讨论

阿尔茨海默病是老年痴呆发病率最高的疾病，预计2050年以后，全球阿尔茨海默病的患病率是目前的4倍，严重危害老年人身心健康，也给家庭和社会带来沉重负担。在对AD患者的研究中，发现许多miRNAs参与了APP和淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACE1）表达的调节，在AD患者脑中含量降低。尸检分析显示，AD大脑中BACE1表达上调是在蛋白质水平，而不是在mRNA水平［3］。转基因小鼠过表达miR-29c可减少BACE1蛋白的水平［4］。这些发现对miRNA的表达与AD发病因果关系提供了支持，不难想象特异性miRNA的缺失可导致散发性AD患者脑组织BACE1和Aβ表达增加，直接通过毒性Aβ的形成，参与AD的发病机制。由此可见，AD的发病与异常表达的miRNA密切相关。如果某种药物能够有效调节正常人中miRNA的表达，或是调节AD患者miRNA的表达趋于正常，将对AD领域的预防或治疗产生不可估量的影响。

本实验着重于对姜黄素作用的研究，实验室前期已完成姜黄素干预AD动物模型的实验［5］，发现姜黄素能够调节海马内小胶质细胞标记物、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及调控凋亡相关基因Bax和Bcl-2，塌陷反应介导蛋白-2（CRMP-2）、P-CRMP-2及轴突蛋白的表达。Ahmed等［6］在实验中也同样发现姜黄素能够明显降低海马中胶质纤维酸性蛋白、caspase-3的水平，说明姜黄素在炎症和凋亡层面上参与AD的治疗。本实验研究结果显示，miR-106a表达与APP呈负相关，姜黄素能够调节miR-106a含量增加，减少APP产生，而在anti-miR-106a存在的情况下，姜黄素的这种作用几乎完全丧失，说明姜黄素对APP的调节是通过调节miR-106a来实现的。

我们的实验也存在某些局限，首先姜黄素的低水溶性对实验有一定程度的限制，可以采用姜黄素类似物解决溶解度问题；其次是设立的姜黄素浓度组较少，对姜黄素的最佳浓度缺乏进一步研究；最后，如果有miR-106a促进剂的加入，能够促进姜黄素的作用，将更能表明姜黄素在AD中对miR-106a的调节作用，增强姜黄素治疗AD的说服力。

［1］Hardy J，Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer＇s disease：progress and problems on the road to therapeutics［J］.Science，2002，297（5 580）：353-356.

［2］Patel N，Hoang D，Miller N，et al.MicroRNAs can regulate human APP levels［J］.Mol Neurodegener，2008，3（1）：1 016.

［3］Hébert SS，HorréK，Nicola L，et al.MicroRNA regulation of Alzheimer＇s Amyloid precursor protein expression［J］.Neurobiol Dis，2009，33（3）：422-428.

［4］Zong Y，Wang H，Dong W，et al.miR-29cregulates BACE1 protein expression［J］.Brain Res，2011，13（1 395）：108-115.

［5］Wang Y，Yin H，Wang L，et al.Curcumin as a potential treatment for Alzheimer＇s disease：a study of the effects of curcumin on hippocampal expression of glial fibrillary acidic protein［J］.Am J Chin Med，2013，41（1）：59-70.

［6］Ahmed T，Gilani AH.A comparative study of curcuminoids to measure their effect on inflammatory and apoptotic gene expression in an Aβplus ibotenic acid-infused rat model of Alzheimer＇s disease［J］.Brain Res，2011，11（1 400）：1-18.

（收稿2014-05-12）

Effects of curcumin on miRNA106a in the cell model of Alzheimer＇s disease

Qiao Nana*，Wang Yunliang
*The Class of2011 Neurology Graduate Student of Weifang Medical School，Weifang201053，China

Objective To investigate the relationship between curcumin and miR-106ain Alzheimer's disease.Methods PC12cells were randomly divided into 5groups，namely，normal control group，model group（cultured with 4μg／mL Abeta1-42for 24hours），anti-miR-106agroup（transfected with anti-miR-106a），curcumin group（adding 20μmol／L curcumin）and coaction group（adding curcumin and anti-miR-106a）.The miR-106acontent of each group was detected by RT-PCR and APP content was detected by Western blotting.Results RT-PCR showed that the concentration of miR-106adecreased significantly in model group and anti-miR-106agroup but increased markedly in curcumin group compared with normal control group.Western-blotting showed that the APP content increased significantly in APP model group and anti-miR-106agroup but decreased markedly in curcumin group compared with normal control group.Conclusion Curcumin maybe positively regulate miR-106ain alzheimer's disease.

Curcumin；miR-106a；Anti-miR-106a；Alzheimer's disease

R749.1+6

A

1673-5110（2015）02-0041-03