MRP1基因表达与耐药性癫痫的相关性研究

王 燕 张 庆河南安阳市第六人民医院神经内科 安阳 455000 2）宁夏医科大学总医院神经内科 银川 750004 3）宁夏颅脑疾病重点实验室银川750004

MRP1基因表达与耐药性癫痫的相关性研究

王 燕1）张 庆2，3）△
1）河南安阳市第六人民医院神经内科 安阳 455000 2）宁夏医科大学总医院神经内科 银川 750004 3）宁夏颅脑疾病重点实验室银川750004

目的 研究MRP1基因表达与耐药性癫痫的相关性。方法 选取90例符合诊断标准的癫痫患者，其中药物敏感患者50例，癫痫耐药患者40例。采用实时荧光定量PCR方法检测癫痫患者外周血中MRP1基因mRNA的表达水平。结果 耐药性癫痫组MRP1基因mRNA表达量（9.52±1.38）高于药物敏感组（1），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 癫痫患者外周血中MRP1的表达水平，可作为诊断耐药性癫痫的参考指标。

癫痫；耐药性；MRP1基因；实时荧光定量PCR

癫痫是由多种病因引起的慢性脑功能障碍综合征，以脑部神经元反复超同步放电所致的突然、反复和短暂的中枢神经系统功能失常为特征。经正规的抗癫痫药物（antiepileptic drugs，AEDs）治疗后，大部分患者癫痫发作可以控制或缓解，但仍有约30％的患者对各种AEDs不敏感，成为耐药性癫痫［1-2］。关于癫痫的耐药机制一直是研究热点，但迄今为止仍未阐明。研究表明，多药耐药相关蛋白基因1（multidrug resistance-associated protein，MRP1）的高表达可能与癫痫耐药存在一定的相关性。MRP1基因位于染色体16p13.1，转录一段7.8～8.2kb mRNA，编码一种相对分子量为190的蛋白，命名为多药耐药相关蛋白1［3］。本研究中，我们对癫痫患者外周血中MRP1基因的mRNA表达水平进行检测，进一步探讨MRP1基因表达与癫痫耐药的关联。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组 本研究病例来源于2012-05—12在宁夏医科大学附属医院神经内科癫痫门诊就诊的癫痫患者。纳入标准：（1）经临床发作和（或）脑电图发现痫样放电确诊的癫痫患者，且经颅脑MRI或CT检查未见进行性中枢神经系统疾病或占位病变；（2）入选本研究前，患者应用AEDs正规治疗，且药物血药浓度在有效范围内或己达临床常用最大剂量。耐药组［4-5］癫痫患者入选标准：入组前1a至入组时癫痫发作较前减少＜50％者；且影响日常生活；药物敏感组［4-5］癫痫患者入选标准：入组前1a至入组时癫痫发作较前减少≥50％者；（3）患者本人或其监护人签署知情同意书。排除标准：（1）服用MRP的底物类药物（AEDs除外）和（或）抑制剂类药物；（2）有严重器质性疾病、先天性代谢异常疾病或脑炎、脑肿瘤、脑血管病等患者；（3）妊娠或哺乳期妇女。

1.2 试验仪器及试剂 荧光定量PCR仪（美国伯乐公司，iQ5），台式离心机（德国HERMLE公司），DYY-6D电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像系统（BIO-RAD意大利米兰）；紫外线分光仪（BIO-RAD美国）；HP1100高效液相色谱仪（安捷伦美国）。血液总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购自Promega北京生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 总RNA提取：采集癫痫患者外周静脉血约2mL，2h内用RNA提取试剂盒从血液中提取总RNA。所提取的总RNA经凝胶电泳检测其完整性并使用紫外分光光度仪检测其纯度和浓度，要求A260／A280在1.8～2.0。

1.3.2 cDNA合成：反应体系：MgCl24μL，反转录10×缓冲液2μL，dNTP混合物2μL，重组的RNasin核糖核酸酶抑制剂0.5μL，AMV反转录酶15U，Oligo（dT）引物0.5μg，总RNA 1μg，加无核酸酶的水至终体积为20μL。反应条件：42℃温育15min，95℃加热5min，然后置于冰上5min，将cDNA放入-80℃冰箱保存，备用。

1.3.3 实时荧光定量PCR反应：根据Genebank人类MRP1基因的cDNA序列，应用引物设计软件Primer 5.0设计引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成，扩增产物为124bp：Premier F：5＇-GTCATCCTTGCTCTCTACCTCCT-3＇；Premier R：5＇-CCTGATACGTCTTGGTCTTCATC-3＇；以β-actin作为内参照，引物设计方法同上，扩增产物为205 bp：Premier F：5＇-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3＇，Premier R：5＇-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3＇。反应体系：cDNA模板4μL，上、下游引物各1μL，Green qPCR SuperMix 12.5μL，加无酶水至25μL。反应条件：94℃变性5min；94℃30s，62℃30s，72℃30s，重复40个循环；72℃7min，4℃保存。每例样品设2个平行复孔，取平均值。反应结束后，由软件自动得出荧光反应曲线以及每个标本反应体系的扩增效率（efficiency）及Ct值。

1.3.4 结果计算：本研究采用公式法（N＝2△△Ct）进行相对定量，比较不同基因的差异表达［6］。实验结果计算如下：△Ct＝Ct目的基因-Ct内参，△△Ct＝△Ct样品-△Ct基准。

1.4 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理，数据以均数±标准差表示，数据经正态检验后，2组间比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药组与敏感组癫痫患者一般资料比较 耐药组与敏感组癫痫患者在性别、年龄、发病年龄、病程以及发作类型等方面比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 耐药组与敏感组癫痫患者一般资料比较

2.2 2组MRP1和β-actin基因相对表达量比较 以药物敏感组△Ct平均值作为校正数，结果显示差异有统计学意义（P＜0.05），耐药性癫痫组MRP1基因mRNA表达水平高于药物敏感性癫痫组。结果见表2，扩增曲线见图1。

表2 2组癫痫患者MRP1基因相对表达量比较

图1 qPCR扩增曲线：A为MRP1基因扩增曲线，B为β-actin基因扩增曲线

3 讨论

耐药性癫痫的具体机制目前尚不清楚，随着分子生物学技术的发展，越来越多的文献证实，MRP1基因在耐药性癫痫患者脑组织中过度表达，在癫痫耐药中起重要作用［7］。其参与的耐药机制可能为：MRP1在血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的血管内皮细胞过度表达，通过主动转运的方式将作为其底物的AEDs从细胞内转运至细胞外，使中枢致痫灶内的AEDs难以达到有效的抗癫浓度，从而导致癫痫耐药［8］。

近年来通过抑制转运体机制的动物实验及在体微透析技术，证明多种AEDs为MRP1蛋白的底物。Van Vliet EA等［9］在诱导癫痫持续状态的大鼠模型中，检测到MRP1基因的高表达后，给大鼠模型肌注苯妥英钠，与野生型大鼠比较，大鼠脑中与血中苯妥英钠浓度比明显低于野生型。Hoffmann等［10］将大鼠模型的MRP1基因敲除后，检测大鼠脑细胞间液苯妥英钠浓度较未敲除MRP1基因的大鼠明显增高。Potschka等［11］给予小鼠微透析模型局部灌注MRP1抑制剂-丙磺舒后发现，丙戊酸钠、苯妥英、卡马西平等抗癫痫药物的脑细胞外液浓度明显提高。马爱梅等［12］通过建立癫痫大鼠模型，同样给予丙磺舒干预后，向大鼠腹腔内注射拉莫三嗪，发现丙磺舒干预组大鼠海马神经元细胞外液拉莫三嗪血药浓度明显高于未干预组。以上研究表明卡马西平、苯妥英钠、丙戊酸钠、拉莫三嗪可能是MRP1的底物。为进一步探讨MRP1基因与癫痫耐药的关联，我们从癫痫患者外周血中检测MRP1基因的表达水平，并在癫痫耐药组和药物敏感组之间进行比较。结果发现耐药组癫痫患者外周血中MRP1基因mRNA表达水平高于癫痫药物敏感组（P＜0.05）。回顾既往国内外对MRP1基因与癫痫耐药的相关研究，结论与本研究一致。根据本研究结果我们推论：在耐药性癫痫患者脑组织和外周血细胞中MRP1基因的表达水平可能是同步的，都呈过表达，且同样参与了癫痫耐药。今后我们可通过更进一步的研究探讨两者表达水平的确切关系及参与癫痫耐药的具体机制。既往相关研究是从脑组织中取材检测MRP1基因的表达水平，操作复杂，且不可能针对每一个癫痫病人，本研究则克服了上述缺点，取材简单易行，快速检测。关于MRP1基因高表达的具体机制，可能与基因多态性、癫痫发作频率或长期应用AEDs有关，也可能是多种因素和机制共同作用的结果。

虽然引起耐药性癫痫患者MRP1基因过表达的具体机制不是十分清楚，但其仍有显著的临床应用价值。通过检测外周血中MRP1基因的表达水平，可作为一个诊断耐药性癫痫的参考指标，预测评估癫痫耐药，这就为我们临床诊断耐药性癫痫提供了客观依据。在临床工作中，可适时检测外周血中MRP1基因的表达水平，充分发挥其临床应用价值，如用药前即检测到MRP1基因呈高表达，则表示可能存在内源性多药耐药；如治疗中检测发现MRP1基因的表达逐渐升高，则提示有可能发生癫痫耐药，可有针对性地选择药物，制定合理的方案，尽可能减少耐药性癫痫的发生。早期识别耐药性癫痫，有利于早期选择合适的治疗，改善患者的预后。对MRP1底物的研究，是为在癫痫治疗上开辟新的途径。如检测到癫痫患者MRP1呈高表达，我们可避免应用作为其底物的AEDs，或在其基础上添加MRP1抑制剂。目前研究发现，丙磺舒、磺吡酮、苯溴马隆等可作为MRP1的抑制剂［13］，通过抑制脑组织中MRP1对药物的外排作用及抑制耐药性癫痫患者脑及其他脏器MRP1的高表达，从而加强抗癫痫作用。但鉴于MRP1抑制剂对中枢神经系统的不良反应，目前应用受限。故对MRP1底物及其抑制剂的进一步研究，是目前癫痫研究领域的新目标。

［1］Soranzo N，Cavalleri GL，Weale ME，et al.Identifying candidate causal variants responsible for altered activity of the ABCB1multidrug resistance gene［J］.Genome Research，2004，1 314（7）：1 333-1 344.

［2］Hung CC，Tai JJ，Lin CJ，et al.Complex haplotypic effects of the ABCB1gene on epilepsy treatment response［J］.Pharmacogenomics，2005，6（4）：411-417.

［3］Cole SP，Bhardwaj G，Gerlach JH，et al.Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line［J］.Science，1992，258：1 650-1 654.

［4］Steffen B，Maren F，Carlos LT，et al.Valproic Acid Is Not a Substrate for P-glycoprotein or Multidrug Resistance Proteins 1 and 2in a Number of in Vitro and in Vivo Transport Assays ［J］.Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2007，320：331-343.

［5］Van Vliet EA，Redeker S，Amnica E.Expression of multidrug transporter MRP1，MRP2and BCRP shortly after status epileptieus，during the latent period，and in chronic epileptic rats ［J］.epilepsia，2005，46（10）：1 569-1 580.

［6］纪冬，辛绍杰.实时荧光定量PCR的发展和数据分析［J］.生物技术通讯，2009，4（20）：598-600.

［7］赵广健.多药耐药相关蛋白与难治性癫痫［J］.国际神经病学神经外科学杂志，2011，38（4）：338-341.

［8］Remy S，Beck H.Molecular and cellular mechanisms of pharmaco resistance in epilepsy［J］.Brain，2006，129：18-35.

［9］van Vliet EA，Redeker S，Aroniea E，et al.Expression of multidrug transporters MRP1，MRP2，and BCRP shortly after status epflepfieus，during the latent period，and in chronic epileptic rats［J］.Epilepsia，2005，46（10）：1 569-1 580.

［10］Hoffmann K，lawher W.Upregulation of brain expression of P-glycoprotein in MRP2-deficient TR-Rats resembles seizureinduced up-regulation of this drug efflux transporter in nomud rats［J］.Epilepsia，2007，48（4）：631-645.

［11］Potschka H，Fedmwitz M，Loscher W.P-glycoprotein and multidmg resistance-associated protein are involved in the regulation of extracellular levels of the major antiepileptic drug carbamazepine in the brain［J］.Neuroreport，200l，12 （16）：3 557-3 660.

［12］马爱梅，张守文，刘玉玺，等．多药转运蛋白对匹罗卡品癫痫大鼠模型脑内拉莫三嗪浓度的影响［J］.中华神经科杂志，2009，42（8）：551-554.

［13］Keppler D.Multidrug resistance proteins（MRPs，ABCCs）：importance for pathophysiology and drug therapy［J］.Handb Exp Pharmacol，2011，201：299-323.

（收稿2014-03-20）

Study on the correlation of between MRP1 gene expression and drug-resistance epilepsy

Wang Yan*，Zhang Qing
＊Department of Neurotogy，the sixth People＇s Hospital of Anyang，Anyang455001，China

Objective To investigate the correlation of between MRP1gene expression and drug-resistance epilepsy.Methods 90with epilepsy were divided into 50cases of AEDs sensitive patients and 40cases of AEDs resistance patients.The mRNA expression of MRP1gene was detected by Real-time fluorescent quantitation PCR.Results The mRNA expression quantity of MRP1gene in AEDs resistance patients was higher than that in AEDs sensitive patients（9.52±1.38vs 1），which had significant difference（P＜0.05）.Conclusion The expression level of MRP1gene in peripheral blood can be used an index to evaluate the drug-resistance epilepsy in epilepsy patients.

Epilepsy；Drug-resistance；MRP1gene；Real-time fluorescent quantitation PCR

R742.1

A

1673-5110（2015）02-0008-03

2011年度宁夏自治区科技攻关项目；2012年度宁夏医科大学校级项目

△通讯作者：张庆，E-mail：nxzhangqing＠aliyun.com