人参根腐病拮抗菌的筛选、鉴定及其抑菌活性

勾长龙，王雨琼,2，孙 朋，毕彦晖，娄玉杰,2，高云航,*

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学 动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林 长春 130118）

人参根腐病拮抗菌的筛选、鉴定及其抑菌活性

勾长龙1，王雨琼1,2，孙 朋1，毕彦晖1，娄玉杰1,2，高云航1,*

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学 动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林 长春 130118）

目的：从人参根际土壤中筛选出拮抗人参根腐病的菌株，初步研究其抑菌作用。方法：采用平板稀释法从人参根际土壤中分离获得菌株，以人参根腐病菌为靶标菌采用平板对峙法筛选出拮抗菌；通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析对筛选出的拮抗菌进行鉴定；检测拮抗菌无菌发酵液对根腐病菌菌丝生长、孢子萌发的影响，同时测定拮抗菌的抑菌谱。结果：分离获得一株对人参根腐病原菌拮抗作用较强的菌株HB-3，经鉴定菌株HB-3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株无菌发酵液对人参根腐病菌菌丝生长和孢子萌发均有显著抑制作用；菌株HB-3的抑菌谱较广，对根腐病菌、疫霉病菌、锈腐病菌、菌核病菌、灰霉病菌均有一定的抑菌活性。结论：筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌HB-3，能显著抑制人参根腐病菌的生长，对人参根腐病有较强的生物防治效果。

根腐病菌；解淀粉芽孢杆菌；无菌发酵液；拮抗谱

人参（Panax ginseng C. A. Mey）系五加科人参属植物人参的干燥根，是一种名贵的中药材[1]。由于其具有抗氧化、抗衰老、增强机体免疫力等多种药理功效，又被誉为“百草之王”[2]。我国的吉林省是人参的主产区，人参的出口量占世界总量的60%，在世界人参产业发展中占有绝对的核心地位[3]，然而人参病害的不断发生严重地限制了吉林人参产业的健康发展。据统计，我国人参病害有30余种，其中最常见且危害最严重的真菌性病毒害包括人参立枯病、人参黑斑病、人参疫病和人参根腐病。人参根腐病主要侵染人参的根部和叶片，造成根部软化腐烂、叶片褪绿变黄，萎蔫死亡[4]。人参根腐病致使人参大面积减产、质量大幅度下降，造成了巨大的经济损失。

目前控制人参根腐病的主要方法仍以化学杀菌剂为主，但由于化学杀菌剂容易出现抗药性和药物残留，不仅污染环境，还严重地威胁人体健康。随着人们对无公害食品的需求的日益增加以及对环境保护的日益关注，生物防治成为了人们控制植物病害的理想途径[5-6]。因此，筛选出生物活性高、抗菌谱广的菌株具有重要的意义。目前国内外对番茄[7]、大蒜[8]、黄瓜[9]等植物生物防治的研究已经取得了较大的进展，但对人参病毒害的生物防治还罕有报道。本研究从人参的根际土壤中筛选出一株对人参根腐病病原菌有极强拮抗作用的菌株HB-3，对其进行生理生化、16S rDNA序列鉴定，并对其防治效果进行了初步探讨，以期为开发出具有应用价值的生防菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土样

供试土样采自吉林长白县、靖宇县和四海县多年轮作无病害的人参土壤，以及人参根系部的土壤。

1.1.2 培养基

NA培养基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 15.0 g、琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃高压灭菌20 min。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然，121 ℃高压灭菌20 min。

1.1.3 供试菌株

人参根腐病菌（Fusarium solani）、人参疫病菌（Phytophthora cactorum）、人参灰霉病菌（Botrytis cinerea）、人参锈腐病菌（Cylindrocarpon destructans）、人参菌核病菌（Sclerotinia schinseng），均由吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分离纯化

称取10 g样品转移至盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，摇床振荡2 h后静置1 h。取上清液稀释为10－1～10－77 个稀释度，分别涂布于PDA和NA培养基上。在PDA培养基上28 ℃培养3～7 d，在NA培养基上37 ℃培养1～4 d，根据菌落的形态特征挑取单菌落进行纯化培养并保存菌种。

1.2.2 拮抗菌筛选

采用平板对峙法将已培养3 d的根腐病菌打孔移取菌块到PDA培养基中央，将4 片滤纸片（直径5 mm）距平板边缘2 cm成对角线贴在平板上，三片接入5 μL菌液，一片接入5 μL无菌水。28 ℃培养5 d，利用电子游标卡尺测量抑菌圈。

1.3 拮抗菌HB-3的鉴定

1.3.1 生理生化鉴定

参照《微生物分类学》[10]和《伯杰细菌鉴定手册》[11]对菌株HB-3进行革兰氏染色、芽孢染色鉴定，同时进行生化实验鉴定。

1.3.2 分子生物学鉴定

提取拮抗菌HB-3的基因组DNA，以提取的DNA为模板（上游引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，下游引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成），聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增拮抗菌株的16S rDNA，PCR回收产物与载体pMD-18T连接后转化E. coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，经菌落PCR鉴定后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。并将获得的序列与美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中已有的ITS基因序列进行比对分析，利用DNAstar构建系统进化树，根据菌株间的亲缘关系确定所选菌株HB-3的种属。

1.4 拮抗菌HB-3的抑菌活性

1.4.1 HB-3无菌发酵液对人参根腐病菌的拮抗活性测定

将拮抗菌HB-3 12 000 r/min离心后取上清液，经滤器（直径0.22 μm）过滤去除菌体获得无菌发酵液。挑取一环人参根腐病菌菌丝在5 mL无菌水中混匀，均匀涂布在平板上，按1.2.2节方法测定无菌发酵液的拮抗活性。

1.4.2 不同体积分数HB-3无菌发酵液对人参根腐病菌的拮抗活性测定

将无菌发酵液分别以体积分数1%、2%、5%、10%、20%的比例与PDA培养基混合，每平板10 mL混合培养基，在混合培养基中央放置人参根腐病的菌块（直径5 mm），每个处理3 个重复，设无菌水处理为空白对照，28 ℃培养4～5 d后测定菌落直径，计算菌丝生长抑制率。

1.4.3 HB-3无菌发酵液对人参根腐病菌孢子萌发的影响

将人参根腐病菌配制成孢子悬液，将孢子悬液分别与拮抗菌以体积分数5%、10%、20%、30%、50%的比例混合，每个处理3 个重复，设置无菌水与孢子悬浮液混合为对照，于28 ℃培养24 h后检查孢子萌发情况（以孢子芽管长度大于孢子短半径判定为萌发），计算孢子萌发抑制率。

1.5 拮抗菌HB-3抑菌谱的测定

采用平板对峙法将已培养3 d的供试人参病原菌（疫病菌、灰霉病菌、锈腐病菌、根腐病菌、菌核病菌），打孔取菌块移到PDA培养基中央，4 周放置4 个直径为5 mm的滤纸片，3 个接种待测拮抗菌菌悬液5 μL，1 个设置无菌水处理为对照，每处理3 个重复，28 ℃培养4～5 d后测定菌落直径，计算菌丝生长抑制率。

1.6 数据处理

采用Microsoft Excel软件和最小显著差异法（least significance difference，LSD）进行数据整理和统计，用SPSS 17.0统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 人参根际土壤中拮抗菌HB-3的分离和筛选

采用平板稀释法从人参根际土壤中分离出35 株菌株，利用平板对峙法筛选出9 株对人参根腐病菌有抑菌活性的拮抗菌（表1），其中菌株HB-3的抑菌活性最强，抑菌圈直径达到46.5 mm，结果见图1。

表1 拮抗菌HB-3对人参根腐病菌的抑菌活性Table 1 Antibiotic activity of antagonistic isolates on Fusarium solani

图1 菌株HB-3对人参根腐病菌菌丝的拮抗作用Fig.1 Antagonistic activity of strain HB-3 against Fusarium solani

2.2 拮抗菌HB-3的鉴定

2.2.1 菌株HB-3培养形态特征及生理生化特征

菌株HB-3在NA固体培养基上培养24 h，菌落呈圆形，乳白色，边缘不规则，表面干燥褶皱，有黏性。镜检结果显示，菌株HB-3呈杆状，产芽孢，革兰氏染色阳性，芽孢染色不着色，结合拮抗菌HB-3的生理生化特征（表2），初步鉴定拮抗菌HB-3为芽孢杆菌属（Bacillus spp.）。

表2 HB-3菌株的生理生化实验结果Table 2 Physical and biochemical properties of strain HB-3

2.2.2 拮抗菌HB-3 16S rDNA序列分析与系统进化树构建

图2 菌株HB-3 PCR产物电泳结果Fig.2 Electrophoresis of PCR products from strain HB-3

图3 菌株HB-3 16S rRNA基因系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of stain HB-3

以菌株HB-3基因组DNA为模板，利用16S rDNA细菌通用引物进行PCR扩增，测得菌株HB-3 16S rDNA核苷酸序列长度为1 472 bp（图2），将序列通过NCBI比对后，选取相似序列构建系统进化树（图3）。结果表明，拮抗菌HB-3与Bacillus amyloliquefaciens strain RNB-1同源性达到100%，综合菌体形态、生理生化实验结果以及16S rDNA序列分析鉴定菌株HB-3为解淀粉芽孢杆菌。

2.3 拮抗菌HB-3的抑菌活性

2.3.1 HB-3无菌发酵液对人参根腐病菌的拮抗活性

图4 菌株HB-3无菌发酵液（A）以及不同体积分数无菌发酵液（B～F）对人参根腐病菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of sterile fermentation medium (A) and different concentrations (B-F) of cell-free fermentation fi ltrate on Fusarium solani

表3 菌株HB-3无菌发酵液对人参根腐病菌菌丝生长的影响Table 3 Inhibition of HB-3 on mycelial growth of Fusarium sollaannii

如图4和表3所示，拮抗菌HB-3的无菌发酵液对人参根腐病菌具有较好的抑菌活性，随着无菌发酵液体积分数的增加，人参根腐病菌菌落逐渐变小，菌丝变短减少。当添加无菌发酵液体积分数达到20%时，可明显看出人参病原菌菌落显著变小，显微镜下观察发现，菌落菌丝变形明显，大部分菌丝弯曲，一部分出现断裂，一部分菌丝出现肿胀现象。

2.3.2 拮抗菌HB-3无菌发酵液对人参根腐病病菌孢子萌发的影响

将人参根腐病菌孢子悬液与不同体积分数的拮抗菌HB-3无菌发酵液混合培养，培养24 h后利用光镜检查萌发的孢子数。如表4所示，随着无菌发酵液体积分数的增加，萌发孢子数逐渐减少，当无菌发酵液体积分数达到50%，HB-3无菌发酵液对人参根腐病菌孢子萌发抑制率最大，为72.3%。

表4 菌株HB-3无菌发酵液对人参根腐病菌孢子萌发率的影响Table 4 Inhibition of HB-3 on spore germination of Fusarium sollaannii

2.4 拮抗菌HB-3的抑菌谱

图5 菌株HB-3的拮抗菌谱Fig.5 Antagonistic spectrum of strain HB-3

将菌株HB-3对5 株病原菌菌株进行抗菌谱测定。由图5可知，菌株HB-3对人参根腐病菌、人参疫病菌、人参菌核病菌、人参灰霉病菌、人参锈腐病菌均有较好的抑菌作用。如表5所示，HB-3对人参根腐病菌的抑菌圈最大，直径为46.5 mm，抑菌率达到64.2%；其次是人参疫病菌和人参菌核病菌，抑菌圈直径分别为31.6 mm和23.4 mm，但对人参灰霉病菌的拮抗作用较差，抑菌率只有20.8%。

表5 菌株HB-3对5 种病原真菌菌落生长的抑菌作用Table 5 Diameters of Inhibition circles of HB-3 against 5 plant pathogens

3 讨 论

本实验采用平板稀释法从10 份人参根系土壤中，分离得到35 株细菌，经平板对峙实验筛选到一株对人参根腐病菌具有较强拮抗作用的细菌HB-3，根据其菌落形态、培养特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，将菌株HB-3鉴定为解淀粉芽孢杆菌。由于芽孢杆菌具有分布广泛、抗逆性强，且无毒害作用等特征，一直以来都是防治植物病毒害生防菌中的最理想选择[12]。解淀粉芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的重要成员，其在生物防控方面的潜能也逐渐被发掘，Dionisio[13]利用Bacillus amyloliquefaciens DGA14防治香蕉的冠腐病取得了较好的效果；Chen Da等[14]利用Bacillus amyloliquefaciens S20控制茄子的细菌性枯萎病效果显著；贾斌等[15]利用解淀粉芽孢杆菌拮抗人参黑斑病菌，抑制率达到80%；本实验研究解淀粉芽孢杆菌HB-3对人参根腐病菌的抑制作用，结果表明菌株HB-3不仅对人参根腐病菌有较强的抑制作用和较好的防治效果，还对人参灰霉病菌、人参疫病菌、人参菌核病菌具有较强的抑菌活性，进一步验证了HB-3是人参病害生物防治的良好资源，具有较大的开发潜能。

大量的实验已经表明拮抗菌对植物病害防治的作用机制主要包括两种：一种是分泌抑菌物质；一种是竞争空间位点和营养[16]。本实验中菌液与无菌发酵液的抑菌能力无明显差异，故拮抗菌通过竞争空间位点和营养来抑制病原菌的可能性不大。一般认为拮抗菌能够分泌抗菌蛋白[17]、多肽[18]、脂多糖[19]、生物碱[20]等多种抑菌活性物质，本实验中HB-3无菌发酵液既可以抑制菌丝生长，又能抑制孢子萌发，由此推断菌株HB-3是通过分泌某种抑菌活性物质来达到抑菌效果的。另外不同体积分数无菌发酵液对病原菌菌丝孢子的抑制实验表明，无菌发酵液的体积分数越大，对根腐病菌的抑制效果越明显。当HB-3的无菌发酵液体积分数为20%时，对根腐病菌菌丝的生长抑制率达到86.6%，当HB-3的无菌发酵液体积分数为50%时，对根腐病菌孢子萌发抑制率达到72.3%，进一步说明了拮抗菌对根腐病菌的抑制活性与其所产生的抑菌活性物质的多少成正相关[21]。此外，将会在后续研究中进行HB-3抗菌活性物质的分离纯化与鉴定，同时还将研究HB-3对离体叶片及果实的防控效果，进而实行人参大田应用，以期开发出一种高效杀菌、环保友好型的微生物菌剂。

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Screening and Identifi cation of an Antagonistic Strain against Fusarium solani and Analysis of Its Antipathogenic Activity

GOU Changlong1, WANG Yuqiong1,2, SUN Peng1, BI Yanhui1, LOU Yujie1,2, GAO Yunhang1,*
(1. College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Key Laboratory of Animal Production, Product Quality and Security, Ministry of Education, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: An antagonistic strain against Fusarium solani was selected from the rhizosphere soil of ginseng, and its inhibitory effect on plant pathogens was researched preliminarily. Methods: The strain was separated from the rhizosphere soil of ginseng by the plate dilution method, selected directly using the pathogenic fungus Fusarium solani as the indicator strain, and identifi ed based on morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA phylogenetic analysis. The effects of the cell-free fermentation fi ltrate on mycelial growth and spore germination of pathogenic fungi were determined. Meanwhile, the antagonistic spectrum of the antagonistic strain was assessed. Results: Strain HB-3 was isolated from the rhizosphere soil of ginseng and exhibited an excellent antagonistic effect on Fusarium solani. It was identifi ed as Bacillus amyloliquefaciens. Inhibition zone test and growth inhibition detection showed that strain HB-3 had the strongest inhibitory effect on mycelium and spores of pathogenic fungi, and displayed a wide antagonistic spectrum, suggesting obvious inhibition on fungal pathogens of ginseng such as Fusarium solani, Phytophthora cactorum, Cylindrocarpon destructans, Sclerotinia schinseng and Botrytis cinerea. Conclusion: Strain HB-3 has a strong effect on biological control of Fusarium solani showing a signifi cant inhibitory effect on the growth of the pathogenic fungus.

Fusarium solani; Bacillus amyloliquefaciens; cell-free fermentation fi ltrate; antagonistic spectrum

S872

A

1002-6630（2015）19-0143-05

10.7506/spkx1002-6630-201519025

2014-10-23

国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-38）；2013年公益性行业（农业）科研专项（201303091）

勾长龙（1988-），男，博士，研究方向为微生态学。E-mail：543135734@qq.com

*通信作者：高云航（1975-），男，副教授，博士，研究方向为微生态学。E-mail：gaoyunhang@163.com