紫外光辐照对脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用

邹忠义，黄 斐，李洪军*

（1.公安海警学院后勤管理系，浙江 宁波 315801；2.西南大学食品科学学院，重庆 400716）

紫外光辐照对脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素的去除作用

邹忠义1，黄 斐1，李洪军2,*

（1.公安海警学院后勤管理系，浙江 宁波 315801；2.西南大学食品科学学院，重庆 400716）

目的：研究紫外光辐照对脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和T-2毒素的去除作用。方法：测定不同辐照时间、不同辐照距离、不同pH值条件下紫外光辐照对DON和T-2毒素影响，采用高效液相色谱-质谱联用技术测定毒素及其衍生物，外标法定量。结果：经紫外光辐照后，溶液中DON、T-2毒素的质量浓度均随着辐照时间的延长而不断减小，随着辐照距离和pH值的减小而不断减小。pH 7的1.0 μg/mL DON、T-2毒素溶液，在紫外灯功率20 W、辐照距离150 mm条件下辐照60 min后，DON、T-2毒素去除率分别为（84.90±2.52）%、（74.60±2.74）%。紫外光辐照后，毒素溶液中不含有已知的毒素衍生物，可能被转化成新的未知产物。结论：在非碱性条件下，紫外光辐照对DON、T-2毒素具有明显的去除作用。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇；T-2毒素；紫外光辐照；高效液相色谱-质谱

单端孢霉烯族毒素（trichothecenes）是由镰刀菌等真菌产生的有毒次级代谢产物，按结构分成4 种类型：A、B、C、D型[1]。污染食品和动物饲料的主要是A、B型单端孢霉烯族毒素，A型中的T-2毒素是毒性最强的单端孢霉烯族毒素[2]，B型中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是食品和饲料中最常见的单端孢霉烯族毒素[3]。单端孢霉烯族毒素对人和动物具有多种毒性，能够造成呕吐、腹泻、皮肤刺激、拒食、恶心、神经障碍、流产等急性和慢性疾病[4]，高剂量的单端孢霉烯族毒素还能促进白细胞快速凋亡[5]。它们在各种环境条件下普遍存在[6]，目前还没有完全有效地防止其污染的方法，不仅带来巨大的经济损失，同时也对人类食品安全造成巨大的威胁，所以控制食品和饲料中的真菌毒素污染是一项艰巨的任务[7]。辐照被用来研究灭活真菌毒素或降低真菌毒素在食品和饲料中的含量[8-12]。目前关于辐照去除单端孢霉烯族毒素的研究主要是利用γ射线辐照和电子束辐照。Hooshmand等[13]研究了γ射线辐照对DON 和T-2毒素的影响，7.5、20 kGy剂量分别能显著减少T-2毒素、DON的质量浓度。O’Neill等[14]研究了DON在60Co-γ射线辐照中的稳定性，发现水溶液中的DON比玉米中的DON对辐照更敏感，水溶液中DON质量浓度在辐照剂量为1 kGy时开始降低，50 kGy时能完全破坏掉DON，玉米中DON质量浓度在辐照剂量为20 kGy时才开始降低，50 kGy时仍保留80%～90%的DON，用幼鼠肾脏细胞做毒性实验，没发现新的毒性物质。但在干燥状态、辐照剂量为50 kGy时，DON仍能保持稳定。Stepanik[15]、Kottapalli[16]等研究了电子束辐照对DON的影响，发现6～10 kGy的辐照剂量不能降低大麦中DON的质量浓度，55.8 kGy剂量的电子束能降低小麦中17.6%的DON，但对干燥状态的DON并无影响。目前关于紫外光辐照去除单端孢霉烯族毒素的研究报道较少，在很多方面研究数据还处于空白状态，本实验将研究紫外光辐照对单端孢霉烯族毒素的去除作用，探索其去除作用机理，为控制此类真菌毒素提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品DON、脱环氧DON（deepoxydeoxynivalenol，DOM-1）、3-乙酰-DON（3-acetyldeoxynivalenol，3-A-DON）、15-乙酰-DON（15-acetyldeoxynivalenol，15-A-DON）、DON-3-葡萄糖苷、T-2毒素、HT-2毒素、T-2三醇、T-2四醇、新茄病镰刀菌烯醇（neosolaniol，NEO）、T-2四醇四乙酸酯（纯度均≥99%），甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸铵均为色谱纯 美国Sigma-Aldrich公司；盐酸、氢氧化钠均为分析纯 重庆博艺化学试剂有限公司；超纯水通过Milli-Q纯水仪制备 美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

UFLC LC-20AD高效液相色谱仪、Shim-peak UPODS分离柱（150 mm×4.6 mm，3.0 μm）、Shimpeak GPRC-ODS保护柱（8 mm×1.5 mm，5.0 μm）日本Shimadzu公司；Sciex API 4000三重四极杆质谱仪（配有电喷雾离子源及Analyst software 1.5.1数据处理系统） 美国Applied Biosystems公司；美泰t8紫外灯 海宁市海仕照明电器厂；Finnpipette移液器美国Thermo Scientific公司；CPA225D电子天平 德国Sartorius公司；S20P-K pH计 瑞士Mettler-Toledo公司；XW-80A漩涡混合器 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；SIGMA 3-30k离心机 美国Sigma-Aldrich公司；N-EVAPTM 116氮吹仪 美国Organomation Associates公司；聚四氟乙烯滤膜（直径17 mm，孔径0.22 μm） 丹麦Frisenette公司。

1.3 方法

1.3.1 毒素标准储备液和工作液的制备

毒素及其衍生物标准储备液的制备：分别精确称取DON、3-A-DON、15-A-DON、DOM-1、DON-3-葡萄糖苷、T-2毒素、HT-2毒素、T-2三醇、T-2四醇、NEO、T-2四醇四乙酸酯标准品5.0 mg于5 mL容量瓶中，用乙腈溶解、定容，制成1.0 mg/mL毒素及衍生物标准储备液，于－20 ℃条件下避光保存。

毒素及其衍生物标准工作液的制备：将毒素及其衍生物标准储备液，分别用超纯水稀释、定容，制成0.01、0.10、1.00、10.00、100.00 μg/mL的毒素、毒素衍生物及其混合物的标准工作液，于4 ℃条件下避光保存，使用前拿出置于室温条件下30 min，每次使用不超过2 h，每10 d更新。

不同pH值毒素溶液的制备：先将超纯水用0.2 mol/L盐酸溶液和0.2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为3、5、7、9，各取99 mL，在其中加入1 mL 100.0 μg/mL的DON、T-2毒素标准工作液，制成pH值为3、5、7、9的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液，临用前制备。

1.3.2 不同辐照时间辐照DON和T-2毒素

将pH值为7的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液各取10 mL于25 mL具刻度玻璃烧杯中（杯底直径为20 mm），放入紫外灯正下方（液面中心与照射方向垂直），紫外灯功率为20 W、紫外灯管距离液面为150 mm（辐照距离）、室温（25 ℃），分别辐照15、30、45、60 min，处理完后，用超纯水定容至10 mL，用高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）测定毒素及其衍生物含量，以未处理毒素溶液为对照。

1.3.3 不同辐照距离辐照DON和T-2毒素

将pH值为7的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液各取10 mL于25 mL具刻度玻璃烧杯中（杯底直径为20 mm），放入紫外灯正下方（液面中心与照射方向垂直），紫外灯功率为20 W、紫外灯管距离液面分别为0、150、200、250、300、350 mm（辐照距离），室温（25 ℃）条件下辐照60 min，处理完后，用超纯水定容至10 mL，用HPLC-MS/MS测定毒素及其衍生物含量，以未处理毒素溶液为对照。

1.3.4 不同pH值条件下辐照DON和T-2毒素

将pH值为3、5、7、9的1.0 μg/mL DON、T-2毒素工作液各取10 mL于25 mL具刻度玻璃烧杯中（杯底直径为20 mm），放入紫外灯正下方（液面中心与照射方向垂直），紫外灯功率为20 W、紫外灯管距离液面为150 mm（辐照距离），室温（25 ℃）条件下辐照60 min，处理完后，用超纯水定容至10 mL，用HPLC-MS/MS测定毒素及其衍生物含量，以未处理的不同pH值毒素溶液为对照。

1.3.5 HPLC-MS/MS测定DON及其衍生物、T-2毒素及其衍生物含量

将含有不同质量浓度毒素及其衍生物的标准工作液以及待测溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液收集到HPLC进样瓶中，于4 ℃条件下保存，最后用HPLC-MS/MS分析。以标准工作液中被测组分峰面积为纵坐标，以被测组分质量浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，对待测溶液中毒素及其衍生物进行定量。按照下式计算毒素去除率[17-18]。

1.3.6 HPLC条件

流动相：A（水，含2 mmol/L醋酸铵和0.1%甲酸）；B（甲醇）。梯度洗脱：0～5 min，5% B；5～6 min，5%～95% B；6～11 min，95% B。流速：0.3 mL/min。柱温：40 ℃。进样量：30 μL。

1.3.7 质谱条件

表1 DON、T-2毒素及其衍生物的跃迁监测及电喷雾离子源条件Table1 Transitions monitored and ESI source conditions for DON, T-2 toxin and their derivatives

扫描方式：正离子模式扫描；检测模式：多反应检测；气帘气压力：40 psi（氮气）；离子源气体1：60 psi（氮气）；离子源气体2：60 psi（氮气）；离子源温度：650 ℃；界面加热器：ON；电喷雾电压：5 500.00 V；碰撞气压力：10 psi（氮气）；其他条件如表1所示。

1.4 数据处理方法

HPLC-MS/MS测定中采用Analyst software 1.5.1软件进行数据采集和处理。每次测定重复3 次，结果用±s表示。数据统计分析采用PASW Statistics 18软件，差异显著性分析采用一维方差分析，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同辐照时间对DON和T-2毒素去除效果的影响

图1 紫外辐照时间对DON、T-2毒素质量浓度的影响Fig.1 Effect of UV irradiation time on the concentrations of DON and T-2 toxin

由图1可知，经紫外辐照后，溶液中DON、T-2毒素的质量浓度均随着辐照时间的延长而不断下降，这与Murata等[19]的研究结果是一致的。辐照60 min后，溶液中DON、T-2毒素的质量浓度分别为（0.151±0.025）、（0.254±0.027）μg/mL，DON、T-2毒素去除率分别为（84.90±2.52）%、（74.60±2.74）%。

2.2 不同辐照距离对DON和T-2毒素去除效果的影响

图2 紫外辐照距离对DON、T-2毒素质量浓度的影响Fig.2 Effect of UV irradiation distance on the concentrations of DON and T-2 toxin

由图2可知，在不同距离辐照后，溶液中DON、T-2毒素的质量浓度均随着辐照距离的增加而不断增加。辐照距离最短时（150 mm），DON、T-2毒素去除率最高，分别为（84.90±2.52）%、（74.60±2.74）%。辐照距离最长时（350 mm），DON、T-2毒素去除率最低，分别为（25.40±2.93）%、（1.90±1.37）%，与最短辐照距离（150 mm）时相比，去除率分别下降了（59.50±0.41）%、（72.70±1.38）%。

2.3 不同pH值条件下辐照对DON和T-2毒素去除效果的影响

图3 紫外辐照中pH值对DON质量浓度的影响Fig.3 Effect of DON solution pH on DON concentration under UV irradiation

由图3可知，pH值为3、5、7的对照组溶液中DON质量浓度保持稳定；pH值为9的对照组溶液中DON质量浓度降低为（0.935±0.017）μg/mL，DON去除率为（6.50±1.70）%。pH值为3、5、7、9的处理组溶液中DON质量浓度分别降低为（0.083±0.021）、（0.114±0.023）、（0.151±0.025）、（0.865±0.028）μg/mL，DON去除率分别为（91.70±2.10）%、（88.60±2.30）%、（84.90±2.52）%、（13.50±2.80）%。其中pH 9的处理组溶液与对照组溶液相比，DON去除率仅增加（7.00±1.10）%。

图4 紫外辐照中pH值对T-2毒素质量浓度的影响Fig.4 Effect of T-2 toxin solution pH on T-2 toxin concentration under UV irradiation

由图4可知，pH值为3、5、7的对照组溶液中T-2毒素质量浓度保持稳定；pH值为9的对照组溶液中T-2毒素质量浓度降低为（0.950±0.016）μg/mL，T-2毒素去除率为（5.00±1.60）%。pH值为3、5、7、9的处理组溶液中T-2毒素质量浓度分别降低为（0.130±0.020）、（0.140±0.025）、（0.254±0.027）、（0.935±0.023）μg/mL，T-2毒素去除率分别为（87.00±2.00）%、（86.00±2.50）%、（74.60±2.74）%、（6.50±2.30）%。其中pH 9的处理组溶液与对照组溶液相比，T-2毒素去除率仅增加（1.50±0.70）%。

紫外光辐照对DON和T-2毒素去除效果有差异是因为二者分子结构虽然类似，但结构存在差异。DON分子在C8位含有羰基官能团，而T-2毒素分子在C8位不含有羰基官能团。分子结构的不同使得二者在被紫外光辐照时稳定性表现出差异。

2.4 紫外光辐照DON和T-2毒素后的产物分析

在上述经过紫外辐照处理DON、T-2毒素溶液中，对毒素衍生物3-A-DON、15-A-DON、DOM-1、DON-3-葡萄糖苷、HT-2毒素、T-2三醇、T-2四醇、NEO、T-2四醇四乙酸酯进行了检测，发现辐照后的DON、T-2毒素溶液中均不含有这些毒素衍生物，紫外辐照可能将DON、T-2毒素转化为了新的未知产物。

2.5 紫外光辐照去除DON和T-2毒素机理分析

目前关于紫外光辐照对DON和T-2毒素的作用机理研究报道不多。Altug等[20]报道来自低能量源的紫外辐照处理无花果样品能降解45.7%的黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1），首次提出紫外辐照产生的臭氧（O3）对AFB1具有降解作用。根据此报道推测在本实验中紫外辐照对DON、T-2毒素去除作用机理是紫外辐照产生的O3对DON、T-2毒素的作用。Young等[21-22]研究了O3对单端孢霉烯族毒素的作用，在O3低浓度水平时，就能观察到中间产物，基于紫外和MS检测得到的数据，推测单端孢霉烯族毒素降解开始于O3攻击单端孢霉烯族毒素分子中双键，在上面加上2 个原子氧，分子中其他部分没有发生改变，如图5所示。由于各种毒素氧化所需的O3量不同，所以C8位的烯丙基氧化状态显著影响反应，氧化所需的O3量多少顺序为：酮基＞羟基（或酯基）＞丙烯亚甲基（无氧）。氧化作用也对pH值敏感，在pH值为4～6时，所有毒素都容易被氧化，在pH值为7～8时，反应程度取决于C8位的氧化状态，pH值为9时，很少反应或无反应，说明碱性条件抑制O3对毒素的去除作用，这和本实验结果是一致的。Young等还发现，湿润的O3（质量分数为2.97%）对1 000 μg/g的DON处理1 h，能使其含量降低90%，而同样条件下，用干燥的O3处理只能使其含量降低70%。使用体积分数为30%的氯气处理0.5 h能完全去除DON。除此之外，McKenzie等[23]研究发现，在二氢呋喃环末端含有双键的AFB1、黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素M1（AFM1），与不含有双键的AFB2、AFG2、AFG3相比，更容易受到O3和其他氧化剂的攻击。用O3处理15 s，展青霉素、赭曲霉毒素A （ochratoxin A，OTA）、伏马菌素B1（fumonisins，FB1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）含量可降低10%。Proctor等[24]用O3在75 ℃条件下处理花生10 min，发现能减少77%（质量分数，下同）的AFB1、80%的AFG1、51%的AFB2和AFG2。Inan等[25]分别用33、60 mg/mL 的O3处理AFB160 min，发现AFB1的减少量分别为80%、93%。

图5 单端孢霉烯族毒素分子与臭 氧反应的机理[21]Fig.5 Proposed mechanism for the reaction of ozone with trichothecenes[21]

3 结 论

s实验结果表明，紫外光辐照对DON、T-2毒素具有明显的去除作用。在相同紫外灯功率下，DON、T-2毒素去除效果受到辐照时间、辐照距离、毒素溶液pH值的影响。DON、T-2毒素的去除率随着辐照时间的延长而不断增加，随着辐照距离的增加而不断减小，随着毒素溶液pH值的增加而不断减小。因此，在食品和饲料工业中可考虑将紫外光辐照技术作为去除单端孢霉烯族毒素的一种加工方法。

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Removal of Deoxynivalenol and T-2 Toxin by Ultraviolet Irradiation

ZOU Zhongyi1, HUANG Fei1, LI Hongjun2,*
(1. Department of Logistics Management, China Maritime Police Academy, Ningbo 315801, China; 2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China)

The effects of irradiation time, irradiation distance and pH of toxin solutions on the removal of deoxynivalenol (DON) and T-2 toxin by ultraviolet (UV) irradiation were investigated. The concentration of toxins and their derivatives were analyzed by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) and quantifi ed by an external standard method. The concentration of DON and T-2 toxin in solutions decreased with increasing irradiation time and decreasing irradiation distance and pH of toxin solutions. The removal rates of DON and T-2 toxin were (84.90 ± 2.52)% and (74.60 ± 2.74)% after UV irradiation for 60 min under the conditions of 7, 1.0 μg/mL, 20 W and 150 mm for toxin solution pH , toxin concentration , UV light power , and irradiation distance, respectively. The solutions containing DON and T-2 toxin did not contain known derivatives of both toxins after UV irradiation. DON and T-2 toxin might be transformed into new unknown products. DON and T-2 toxin were removed obviously by UV irradiation in non-alkaline condition.

deoxynivalenol (DON); T-2 toxin; ultraviolet irradiation; high performance liquid chromatography-mass spectrometry

TS201.6

A

1002-6630（2015）19-0007-05

10.7506/spkx1002-6630-201519002

2015-05-31

国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（2009CB118806）；宁波市自然科学基金项目（2014A610190）；公安海警学院科研发展基金项目（2013XYPYZ013）

邹忠义（1982-），男，讲师，博士，研究方向为食品科学与工程。E-mail：zzy911zzy911@163.com

*通信作者：李洪军（1961-），男，教授，博士，研究方向为食品科学与工程。E-mail：983362225@qq.com