双波长法测定绿豆中的直链和支链淀粉

黄建蓉 王志江 李丽嫦 区 丽 徐金瑞

（广东药学院食品科学学院，广东 中山 528458）

绿豆是中国传统的食用豆类作物，富含淀粉等碳水化合物。绿豆淀粉具有广泛的用途，有研究者采用单波长法［1］或酶法［2］测定绿豆中总淀粉和直链淀粉含量，也有研究者［3］将双波长法用于13种常用淀粉原料中直链淀粉和支链淀粉的同时测定，其中包括绿豆淀粉。前2种方法在进行样品预处理时，先将淀粉从绿豆中分离出来再进行测定，后1种方法测定的样品是从绿豆中提取出来的淀粉原料，而不是绿豆。双波长分光光度法用于同时测定样品中直链淀粉和支链淀粉含量具有高效、准确的优点，应用日益广泛［4－8］。需要引起注意的是，淀粉样品的显色条件对光度测定结果有一定影响，许多研究者［4，5，8］对此也进行了相关报道。本研究拟采用双波长分光光度法对绿豆中直链淀粉和支链淀粉进行同时测定，样品预处理时无需将淀粉从绿豆中分离出来，可简化操作步骤。研究碘试剂与淀粉的显色反应中影响吸光度和吸光度差值测定结果的因素，并考察方法精密度和加标回收率，对分析方法的可靠性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料

东北绿豆：深圳市永福元工贸有限公司；

金龙鱼白城绿豆：原料产地吉林白城市，嘉里粮油（深圳）有限公司；

韶扬有机绿豆：原料产地辽宁朝阳，菏泽市韶扬农产品有限公司。

1.1.2 试剂

直链淀粉标准品和支链淀粉标准品：美国Sigma公司；

石油醚、无水乙醇、碘、碘化钾、氢氧化钠、盐酸：均为国产分析纯试剂。

1.1.3 仪器与设备

电子分析天平：AEY-220型，湘仪天平仪器设备有限公司；

双光束紫外可见光分光光度计：TU-1901型，北京普析通用仪器责任有限公司；

水浴锅：HH-zk8型，巩义市予华仪器有限责任公司；

高速万能粉碎机：FW1000型，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理 由于天然淀粉中含有的油脂具有碘值即能与碘反应褪色，碘溶于油脂中，会使得液体呈现红至橙红色，影响显色反应［9］。因此，先对绿豆进行脱脂处理后再进行显色测定。绿豆用高速万能粉碎机粉碎并过80目筛，然后用索氏提取法进行脱脂处理，得到脱脂绿豆粉保存于干燥避光处，备用。

1.2.2 碘试剂的配制 称取碘化钾2.0g，溶于少量蒸馏水，再加碘0.2g，待溶解后用蒸馏水稀释定容至100mL，即得2mg/mL的碘试剂，储于棕色瓶中备用。

1.2.3 淀粉标准储备液的制备 准确称取50mg直链淀粉标准品，置于小烧杯中，加入1mL无水乙醇润湿，再加入2 mol/L的氢氧化钠溶液9mL。在90℃恒温水浴中，分散溶解20min，用蒸馏水定容至刻度，即成1mg/mL的直链淀粉标准储备液。

支链淀粉标准储备液制备步骤同直链淀粉。

1.2.4 淀粉标准扫描液的制备及检测波长的确定

（1）直链淀粉标准扫描液：移取1mL直链淀粉标准储备液于50mL容量瓶中，用1mol/L和0.1mol/L的盐酸溶液调至pH＝3，加0.5mL碘试剂，用蒸馏水定容至刻度，静置反应30min，以蒸馏水作参比液，上机进行波长为400～800nm的可见光波段扫描。

（2）支链淀粉标准扫描液：移取4mL支链淀粉标准储备液于50mL容量瓶中，其余步骤同直链淀粉标准扫描液。

（3）在同一坐标内绘制直链和支链淀粉标准扫描液可见光波段吸收曲线，根据作图法确定直链淀粉的测定波长（λ2）和参比波长（λ1）以及支链淀粉的测定波长（λ4）和参比波长（λ3）。

1.2.5 样品显色条件的选择 研究不同显色pH值（2，3，4，5）、显色温度（15，20，25，30℃）和显色时间（15，30，45，60，75，90，105，120，135，150，165，180min）对直链和支链淀粉测定波长下吸光度和吸光度差值的影响，选择适宜的显色条件。

1.2.6 标准曲线的绘制 根据1.2.5得出的显色条件，配制直链淀粉和支链淀粉标准溶液，并绘制标准曲线。

（1）直链淀粉标准曲线的绘制：吸取0.5，0.9，1.3，1.7，2.1，2.5mL的1g/mL直链淀粉标准溶液分别加入50mL的容量瓶中，加入30mL蒸馏水，以1mol/L和0.1mol/L盐酸溶液调至pH＝3，加入0.5mL碘试剂，并用蒸馏水定容，静置 30min，在λ2、λ1两波长下分别测定Aλ2、Aλ1，得△A直＝Aλ2－Aλ1。以直链淀粉浓度（mg/mL）为横坐标，△A直为纵坐标，绘制直链淀粉标准曲线，得出回归方程。

（2）支链淀粉标准曲线的绘制：吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL的1mg/mL支链淀粉标准溶液分别放入50 mL的容量瓶中，其余步骤同直链淀粉标准曲线绘制，在λ4、λ3两波长下分别测定Aλ4、Aλ3，得△A支＝Aλ4－Aλ3。以支链淀粉浓度（mg/mL）为横坐标，△A支为纵坐标，绘制支链淀粉标准曲线，得出回归方程。

1.2.7 精密度试验 对同一样品进行直链淀粉和支链淀粉含量的同时测定，重复6次，计算平均值和相对标准偏差（RSD）。

1.2.8 加标回收率试验 分别称取不同量的直链淀粉和支链淀粉标准品，添加到已测得直链淀粉和支链淀粉含量的样品中，测定加标样品中直链淀粉和支链淀粉的含量，计算回收率。

1.2.9 绿豆样品中直链和支链淀粉含量测定 精确称取脱脂绿豆粉样品0.1g于50mL烧杯内，加入1mL无水乙醇润湿，按照1.2.3的分散条件进行分散，以蒸馏水定容至50 mL。抽滤，取2.5mL的滤液加入50mL的容量瓶中，加入30mL蒸馏水，以1mol/L和0.1mol/L盐酸溶液调节pH，加入0.5mL碘试剂，并用蒸馏水定容到刻度，按照1.2.5筛选的显色条件进行显色反应。在λ2、λ1和λ4、λ3波长下测定吸光度值，根据标准曲线计算含量。

2 结果与分析

2.1 测定波长与参比波长的确定

用直链和支链淀粉标准液分别与碘反应，进行可见光波段扫描（400～800nm），并绘制于同一个坐标系内（见图1），得到直链淀粉的最大吸收波长为λ2＝610nm，支链淀粉的最大吸收波长为λ4＝553nm。按照等吸收点波长法，通过作图确定直链淀粉的测定波长和参比波长分别为λ2＝610nm和λ1＝498nm，支链淀粉的测定波长和参比波长分别为λ4＝553nm和λ3＝709nm。

图1 直链淀粉和支链淀粉标准品扫描图（400～800nm）Figure 1 Spectrogram of amylose and amylopectin（400～800nm）

2.2 样品显色条件的选择

2.2.1 pH值对吸光值的影响 由图2可知，在pH 2～4范围内，A610nm、A553nm、A直和△A支的测定结果都没有明显差异，pH 5的条件下，吸光度和吸光度差值明显减小，因此适宜的显色反应pH范围为2～4。

2.2.2 显色温度对吸光值的影响 由图3可知，当显色温度为20℃时，测得吸光度和吸光度差值均为最大，因此选择20℃作为最适显色温度。

2.2.3 显色时间对吸光值的影响 由图4可知，显色反应进行约15min时，反应尚未完全达到平衡，测定结果不稳定；当显色超过120min后，测得值呈现出较明显的下降趋势。因此建议在显色反应30～120min内对样液进行检测。

图2 显色反应pH对吸光值的影响Figure 2 The infulence of color reaction pH on photometric absorption

图3 显色温度对吸光值的影响Figure 3 The infulence of color reaction temperature on photometric absorption

图4 显色时间对吸光值的影响Figure 4 The infulence of color reactiontime on photometric absorption

2.3 标准曲线的绘制

由图5可知，直链淀粉标准曲线的回归方程为：△A直＝12.411C直－0.044 5（R2＝0.999 4），直链淀粉浓度在10～50mg/L时，溶液浓度与吸光度差值有良好的线性关系。

图5 直链淀粉标准曲线Figure 5 The standard cure of amylose

图6 支链淀粉标准曲线Figure 6 The standard cure of amylopectin

2.4 方法精密度评价

由表1可知，本方法重复性好，用双波长分光光度法同时测定绿豆中直链淀粉和支链淀粉含量精密度高。

2.5 加标回收率

由表2可知，直链淀粉和支链淀粉的平均回收率分别为94.10%和90.94%。由此可见，双波长法同时测定直链淀粉和支链淀粉的含量，结果可靠。

2.6 绿豆中直链和支链淀粉含量测定

由表3可知，直链淀粉含量在11.70%～12.67%，支链淀粉含量在32.70%～34.22%。钟葵等［10］采用爱尔兰Megazyme公司的淀粉试剂盒测定20个绿豆样品中总淀粉和直链淀粉含量，变幅分别为37.48%～47.63% 和10.41%～15.84%。 林 伟 静 等［2］将 绿 豆 淀 粉 从 绿 豆 中 分 离出来后，测得16个品种来源的绿豆淀粉中总淀粉含量和直链淀粉含量变幅分别为85.67%～92.98%和23.65%～34.08%。由此推算直链和支链淀粉质量比在26∶74～39∶61。本研究结果与之一致。李文浩等［1］测得9个品种绿豆总淀粉含量、直链淀粉含量范围分别为54.73%～57.99%，40.44%～41.82%。刘襄河等［3］测得绿豆淀粉中直链和支链淀粉含量分别为56.31%和16.95%，二者质量比大约为77∶23。本研究结果与之差异较大，原因可能是样品来源或检测方法的不同。

表1 方法精密度试验结果Table 1 The precision test results of the method

表2 直链淀粉和支链淀粉的回收率试验结果Table 2 The recovery test results of amylose and amylopectin

表3 3种绿豆中直链淀粉和支链淀粉含量Table3 Amylose and amylopectin content in 3kinds of mung bean（n＝3）

3 结论

双波长分光光度法是对共存组分不分离定量测定的有效方法之一，此法操作简单，精密度高，回收率良好，可以应用于绿豆中直链和支链淀粉含量两个指标的同时测定。

本研究对样品显色反应条件进行探讨，结果表明，适宜的显色反应条件为：pH 2～4，显色温度20℃，显色时间30～120min。

通过双波长吸收光谱图确定了直链淀粉的测定波长和参比波长为610nm和498nm，支链淀粉为553nm和709 nm。建立了直链淀粉和支链淀粉回归方程，直链淀粉在10～50mg/L线性良好（R2＝0.999 4），支链淀粉在20～120 mg/L线性良好（R2＝0.999 1），符合比尔定律。并测得3种绿豆中直链淀粉含量为11.70%～12.67%，支链淀粉含量为32.70%～34.22%，直链淀粉与支链淀粉质量比为26∶74～28∶72。

由于样品来源不同或检测方法不同，不同文献报道的绿豆淀粉含量测定结果差异较大，在实际应用中应加以注意，对影响检测结果的各种因素（如样品中其他组分、样品分散条件等）仍有待深入研究。

1 李文浩，谭斌，刘宏，等.我国9个品种绿豆淀粉的理化性质研究［J］.中国食品学报，2013，13（4）：58～64.

2 林伟静，曾志红，钟葵，等.不同品种绿豆的淀粉品种特性研究［J］.中国粮油学报，2012，27（7）：47～51.

3 刘襄河，郑丽璇，郑丽勉，等.双波长法测定常用淀粉原料中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量［J］.广东农业科学，2013（18）：97～100.

4 常虹，周家华，兰彦平.葛根淀粉提取及直链、支链淀粉的双波长测定［J］.食品工业科技，2009，30（11）：239～240，276.

5 林美娟，宋江峰，李大婧，等.用双波长分光光度法测定鲜食玉米中直链淀粉和支链淀粉含量［J］.江苏农业科学，2010，22（12）：117～119.

6 包锦渊，李军乔，韦梅琴，等.藏药蕨麻中直链淀粉和支链淀粉含量的测定［J］.江苏农业科学，2012，40（3）：281～283.

7 蒋卉，胡中泽.双波长法测定籼米中直链淀粉和支链淀粉含量［J］.粮食与饲料工业，2013（2）：22～25.

8 吴仲，梁一池，陈诗强.锥栗中直链和支链淀粉含量同时检测方法研究［J］.食品与机械，2014，30（2）：72～74，98.

9 崔克宇，吕明，王仁章，等.碘与淀粉反应条件的实验研究［J］.科技信息，2007（12）：29～31.

10 钟葵，佟立涛，刘丽娅，等.绿豆淀粉性质和糊化特性研究［J］.作物杂志，2013（2）：134～138.