高效液相色谱法测定玉米中的游离酚和结合酚

李 艳 刘梅森 万红霞 孙海燕 从彦丽 许柏球 刘 冬

（华南理工大学轻工与食品学院1，广州 510640）（深圳职业技术学院深圳市发酵精制检测系统重点实验室2，深圳 518055）（深圳市味奇生物科技有限公司3，深圳 518109）

高效液相色谱法测定玉米中的游离酚和结合酚

李 艳1，2刘梅森3万红霞2孙海燕2从彦丽2许柏球2刘 冬2

（华南理工大学轻工与食品学院1，广州 510640）
（深圳职业技术学院深圳市发酵精制检测系统重点实验室2，深圳 518055）
（深圳市味奇生物科技有限公司3，深圳 518109）

建立了高效液相色谱法同时测定玉米中游离酚和结合酚的检测方法，包括原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、芦丁、橙皮素、槲皮素。有机溶剂提取玉米中的游离酚，碱法提取玉米中的结合酚，以ZORBAX Eclipse Plus Phenyl－Hexyl（4.6 mm×250 mm，5μm）为分析柱，乙腈（A）和含0.4%乙酸的超纯水（B）为流动相梯度洗脱，采用二极管阵列检测器280 nm波长检测。14种酚类化合物在一定浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系，相关系数为0.999 4～0.999 9，加标回收率为90%～108%，相对标准偏差为0.03%～3.59%。试验结果表明，该方法能用来同时测定玉米中的游离酚和结合酚。

玉米 游离酚 结合酚 高效液相色谱

玉米是世界上分布最广泛的粮食作物之一，和小麦、水稻并列为世界三大粮食作物。因富含酚类化合物，玉米有预防心脏病、高血压、癌症等功效。多酚化合物是广泛存在于自然界的一类含有多个酚羟基结构的化合物［1－2］，主要包括类黄酮、酚酸等物质［3］，具有抗氧化等能力［4－5］，能降低心血管疾病、癌症的发病率，延缓衰老［6－9］。目前对于玉米的研究［10－13］主要集中于采用有机溶剂提取色素、黄酮等酚类化合物，再进行纯化、结构鉴定和活性评价。然而，玉米等谷物中的酚类化合物通过氢键、疏水相互作用或共价键与蛋白质、糖类等结合，根据其结合程度由疏至密依次可分为游离型和结合型［14］。Sosulski等［15］建立了谷物可溶性游离多酚和不溶性结合多酚的分离提取方法。Liu［1］等用该方法比较了部分水果、蔬菜和谷物的多酚化合物含量结果表明，玉米中的酚类主要以结合形式存在，约占总酚的85%。采用有机溶剂提取大大低估了玉米的酚类含量及其生物活性，目前对于结合酚的组成研究甚少。为了准确评估玉米的酚类含量，有必要对玉米中游离酚和结合酚分别进行测定。本试验对玉米中的游离酚和结合酚进行提取，建立了高效液相色谱法测定玉米中的游离酚和结合酚，并对建立的测定方法进行方法学验证。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

SHIMADZU 20A高效液相色谱系统（DGU－20A3在线脱气器、LC－20AT泵、SIL－20A自动进样器、CTO－20A柱温箱、SPD－M20A检测器）：日本SHIMADZU；超纯水机：美国Millipore；高速匀浆机：德国IKA；高速离心机：德国Eppendof；旋转蒸发仪：德国Heidolph。

乙腈（色谱纯）、乙酸（色谱纯）、原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、芦丁、橙皮素、槲皮素：美国Sigma公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl－Hexyl（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱温 30℃；流速1.0 mL／min；进样量 20μL；检测波长为 280 nm；流动相为乙腈（A）和含0.4%乙酸的超纯水（B），梯度洗脱，0～5 min，3%A；5～10 min，3%～7%A；10～25 min，7%～10%A；25～30 min，10%～12%A；30～45 min，12%～15%A；45～50 min，15%A；50～70 min，15%～30%A；70～75 min，30%～3%A；75～80 min，3%A。

1.3 样品前处理

1.3.1 游离酚提取

称取2.0 g绝干样品粉末于100 mL烧杯中，加入50 mL正己烷，冰浴10 000 r／min匀浆 10 min，3 000 g离心5 min。去除上清液。沉淀加入50 mL 80% 冰丙酮，冰浴10 000 r／min匀浆10 min。3 000 g离心5 min，取上清液。用80% 冰丙酮重复提取2次，合并上清液45℃旋转蒸发蒸干。用80%甲醇溶液重溶，定容至10 mL，过0.45μm膜，待测。

1.3.2 结合酚提取

往沉淀里加入20 mL 2 mol／L NaOH，混匀，充满N2室温旋转振荡消化1 h。加4 mL浓HCl，混匀，放置2 min。再加入20 mL乙酸乙酯，摇匀，萃取5 min，3 000 r／min离心5 min，取上清液。下层液体再用乙酸乙酯萃取5次，合并上清液，45℃旋转蒸发蒸干，用80% 甲醇溶液重溶，定容至10 mL，过0.45μm膜，待测。

2 结果和讨论

2.1 色谱条件的选择

酚类化合物含有酚羟基，流动相中加入适当比例的酸可以抑制酚羟基的电离，达到改善分离效果和修饰峰形的作用。本试验考察了乙酸比例（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）对酚类化合物的分离效果及峰形的影响，试验结果表明，当乙酸比例为0.10%～0.30%时，其分离度不佳，当乙酸比例增至0.40%时，其分离度及峰形均有明显改善。故试验最终选择0.4%乙酸水溶液作为最佳流动相。

2.2 线性范围、检出限及定量限

在最佳的色谱条件下，测定不同浓度的酚类混合标准溶液，液相色谱图见图1，以峰面积（Y）为纵坐标，标准溶液的浓度（X，μg／mL）为横坐标作图，得到相应的回归方程（见表1）。结果显示14种酚类化合物分别在 1.33～42.80、12.56～402.00、1.33～42.40、1.93～61.60、1.29～41.20、0.76～24.40、1.46～46.80、4.75～152.00、0.53～16.88、0.88～28.00、8.00～128.00、3.86～123.60、2.70～43.20和3.20～51.60μg／mL范围内具有良好的线性关系，相关系数在0.999 4和0.999 9之间。以3倍信噪比（S／N）测定14种酚类物质的检出限（LOD），以10倍S／N计算定量下限（LOQ），结果见表1。

图1 酚类化合物标准品液相色谱图

表1 14种酚类化合物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量下限

2.3 精密度和稳定性

精密吸取混合标准溶液20μL，按照1.2色谱条件进行分析。重复进样5次，测得原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、芦丁、橙皮素和槲皮素峰面积的 RSD分别为 1.16%、1.12%、1.28%、1.70%、1.35%、1.52%、1.35%、1.31%、1.35%、1.57%、0.87%、1.34%、0.78%和0.79%，结果表明该方法的精密度良好。

准确吸取玉米酚溶液20μL，于0、12和24 h分别进样，测得原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、芦丁、橙皮素和槲皮素峰面积的相对标准偏差RSD分别为0.13%、0.67%、1.19%、0.21%、1.10%、0.51%、0.93%、0.51%、1.80%、1.66%、0.30%、0.93%、1.60%和2.39%，结果表明在24 h内样品的稳定性良好。

2.4 回收率

精密吸取已知含量的同一样品溶液9份，分成3组，每组以低、中、高3个标准加入混合标准溶液，按1.2色谱条件进行分析。原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、芦丁、橙皮素和槲皮素的回收率测定结果见表2。14种酚类成分的加标回收率为90%～108%，说明该方法具有良好的通用性。

表2 14种酚类化合物的加标回收率及相对标准偏差

2.5 再现性试验

以黑玉米为研究对象，按1.3方法制备游离酚及结合酚，平行试验3次，用1.2色谱法进行分析，测得游离酚中原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、芦丁、橙皮素和槲皮素峰面积的RSD分别为 0.04%、0.19%、0.01%、1.51%、0.17%、0.22%、0.17%、0.81%、0.30%、0.72%、0.89%、5.55%、0.95%和0.10%，结果表明该方法的再现性良好。

2.6 实际样品的测定

选取白玉米、黄玉米和黑玉米为研究对象，按1.3方法制备游离酚及结合酚样品，用1.2色谱法进行分析，结果见表3。

测定结果可知，以结合形式存在的阿魏酸是玉米中含量最高的酚类化合物，这与文献［5］报道的阿魏酸是玉米中最主要的酚酸组分相符，与“以结合形式存在的阿魏酸占总阿魏酸的93%以上”也相符。

表3 样品含量的测定结果／μg／mL

3 结论

HPLC法可用于定性定量分析玉米中的游离酚和结合酚，包括原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、芦丁、橙皮素、槲皮素。该法不仅具有快速简便的优点，还有低检出限定量限、高精密度、好稳定性及高回收率的优点。通过对玉米中游离酚和结合酚的测定可知，玉米中的酚类主要以结合酚形式存在，结合酚中主要为阿魏酸，可能以阿魏酸酯等形式存在于玉米中，下一步可采用HPLC－MS法确定玉米中酚类成分的结构。

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Determination of Soluble Phenolics and Bound Phenolics in Corn by High Performance Liquid Chromatography

Li Yan1，2Liu Meisen3Wan Hongxia2Sun Haiyan2Cong Yanli2Xu Baiqiu2Liu Dong2

（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology1，Guangzhou 510640）（Shenzhen Key Laboratory of Fermentation，Purification and Analysis，Shenzhen polytechnic2，Shenzhen 518055）（Shenzhen Weicky Biotech Co.，Ltd3，Shenzhen 518109）

An effective high performance liquid chromatographic（HPLC）method had been developed for the determination of soluble phenolics and bound phenolics，including protocatechuic acid.2.5－Dihydroxybenzoic acid，4－Hydroxybenzoic acid，chlorogenic acid，vanillic acid，caffeic acid，syringic acid，Epicatechin.coumalic acid，ferulic acid，sinapic acid，rutin，hesperetin and quercetin.Soluble phenolics were extracted with organic solvent；bound phenolics were extracted by alkaline.The separation and quantification of soluble phenolics and bound phenolics were achieved on ZORBAX Eclipse Plus Phenyl－Hexyl（4.6 mm×250 mm，5μm）with mobile phase of acetonitrile（A）and 0.4%acetic acid（B）with diode array detector（DAD）at 280 nm.The results indicated that the calibration curves of fourteen phenolics had expressed a satisfied linear relationships between peak areas and concentrations，with their correlation coefficients of 0.999 4～0.999 9，The average recoveries of fourteen phenolics were in the range of 90%～108%with relative standard deviations of 0.03%～3.59%，The method shall be suitable for determination of soluble phenolics and bound phenolics in corn.

corn，soluble phenols，bound phenols，high performance liquid chromatography（HPLC）

TS207.3

A

1003－0174（2015）09－0108－04

广东省国际合作项目（2012B050600031），省部产学研结合项目 （2012B091100411），深圳职业技术学院青年创新项目（601422K27012）

2014－03－31

李艳，女，1982年出生，博士，活性成分功效研究

刘冬，男，1968年出生，教授，食品生物技术