裸燕麦谷蛋白酶解物的纯化及其清除自由基活性研究

马萨日娜 张美莉 付 媛 乌云达来 斯琴其木格

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院1，呼和浩特 010018）（内蒙古农业大学理学院2，呼和浩特 010018）

裸燕麦谷蛋白酶解物的纯化及其清除自由基活性研究

马萨日娜1张美莉1付 媛2乌云达来1斯琴其木格1

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院1，呼和浩特 010018）（内蒙古农业大学理学院2，呼和浩特 010018）

利用碱性蛋白酶对裸燕麦谷蛋白进行酶解，采用超滤及离子交换层析对酶解物进行纯化，然后考察各分离组分清除·OH、DPPH·能力。结果表明：超滤法分离裸燕麦谷蛋白酶解物所得的5个组分中，组分Ⅰ清除·OH能力最强。其质量浓度为3 mg／mL时清除·OH能力高于90%。进一步对组分Ⅰ离子交换分离，所得的4个组分中，组分 D清除·OH（IC501.532 mg／mL）、清除DPPH·（IC501.278 mg／mL）能力高于其他3个组分。分离组分D为碱性氨基酸，清除·OH与DPPH·能力都强于裸燕麦谷蛋白酶解物。

裸燕麦 谷蛋白 酶解 纯化 自由基

具备特殊生理功能的肽类称之生物活性肽（bioactivity peptides），除易消化吸收，还具有人体代谢和生理调节功能。如提高免疫、激素调节、降血压、降血脂、抗疲劳、抗病毒、抗氧化等作用，使其成为国际医药界及食品界热门的研究课题和发展前景广阔的功能因子。由于自由基攻击细胞壁和大分子物质，引起机体病变和损伤，从而加速机体衰老［1－2］。正常生理状况下，机体内产生自由基与清除自由基处于动态平衡状态，但其机体在不良环境或随年龄的增长，体内产生过多自由基或清除过慢。自由基清除剂别名为抗氧化剂，能清除使体内失衡的自由基，从而减轻机体承受的损伤。

抗氧化肽在植物蛋白中的研究较多。Chen等［3］、荣建华［4］、徐力等［5］都从大豆蛋白中分离出具有抗氧化活性的多肽。程云辉等［7］考察了麦胚抗氧化肽。文献［8－10］对荞麦球蛋白、清蛋白及裸燕麦球蛋白提取物进行了清除自由基研究并证实其具有一定抗氧化活性。

燕麦蛋白被证明具有良好的营养价值和功能特性。裸燕麦蛋白质中，除含量最高的球蛋白，谷蛋白含量（20%～25%）［11］也相对较高。本试验对酶解的裸燕麦谷蛋白进行分离纯化，研究清除·OH和DPPH·活性较强的肽段，以期为进一步开发利用裸燕麦谷蛋白资源提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

裸燕麦，贮藏于0～4℃。

732强酸型阳离子交换树脂：江苏临海树脂有限公司；碱性蛋白酶：诺维信（中国）生物技术有限公司；1，1－二苯基 －2－三硝基苯肼（DPPH·）：Sigma公司。

1.2 仪器与设备

紫外－可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；冷冻干燥机FD－2、核酸蛋白层析仪：北京博医康实验仪器公司；层析柱（2.6 cm ×60 cm）：上海锦华层析设备厂；高速冷冻离心机H2500R－2：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；超滤离心管：Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 裸燕麦谷蛋白的制备及其酶解工艺

裸燕麦经去壳、脱毛、磨粉、脱脂后，采用 Osborne法制备裸燕麦谷蛋白。

酶解裸燕麦谷蛋白的工艺流程如图1所示。

图1 裸燕麦谷蛋白酶解的工艺流程

1.3.2 超滤离心法分离纯化裸燕麦谷蛋白酶解物

采用截留分子质量（MWCO）分别为30、10、5和3 ku的超滤管对裸燕麦谷蛋白酶解液进行分级分离。收集所得组分Ⅰ（＞30 ku）、Ⅱ（10～30 ku）、Ⅲ（5～10 ku）、Ⅳ（3～5 ku）、Ⅴ（＜3 ku），并将各组分冻干后测其清除·OH与DPPH·的能力。

1.3.3 离子交换层析纯化裸燕麦谷蛋白酶解物

1.3.3.1 离子交换树脂预处理

1）用水浸泡2～3 h，用去离子水洗至出水澄清，除去杂质，再倾去水。

2）加入2倍体积2%NaOH溶液，搅拌4 h。

3）除去碱液，水洗至pH 8～10.

4）加入2倍体积4%盐酸溶液，搅拌4 h。

5）除去酸液，水洗至中性，此时树脂已转为H型。

1.3.3.2 离子交换层析纯化酶解物

将超滤所得的清除自由基活性最强的组分溶于醋酸氨缓冲液（pH 4.5）配制成质量浓度为24 mg／mL的溶液。将选型后的离子交换树脂装柱（柱尺寸：2.6 cm×60 cm），用pH 4.5的醋酸氨缓冲液平衡柱子12 h后上样，以0.2 mol／L氨水等速（1.0 mL／min）洗脱，并用分步收集器收集洗脱液（4 mL／管），于220 nm下检测吸光值，将属于同一峰的收集液混合，冻干后分析其清除·OH与DPPH·的能力。

1.4 裸燕麦谷蛋白酶解物清除自由基活性测定

1.4.1 对·OH清除作用的测定

［12］方法进行测定。

1.4.2 对DPPH·清除作用的测定

参考文献［13］的方法，并有所改进。

试剂配置：用无水乙醇溶解9.858 mg DPPH·并定容至25 mL棕色容量瓶中，配成1 mmol／L的溶液，冷藏放置，用时用无水乙醇稀释10倍成0.1 mmol／L的溶液。

方法：将2 mL超纯水和2 mL样品分别加入等体积DPPH·无水乙醇溶液（0.1 mmol／L），充分荡使其溶解于室温下反应30 min，用分光光度计在517 nm下测OD值，得到A0和A1。A2由2 mL样品加入等体积无水乙醇测定：

2 结果与分析

2.1 裸燕麦谷蛋白酶解粗提物的清除自由基能力

裸燕麦谷蛋白酶解粗提物清除·OH、DPPH·作用如图2所示，酶解物对2种自由基的清除率随其终质量浓度的增加呈二次曲线上升趋势。清除·OH、DPPH·的 IC50分别为3.933、2.318 mg／mL。

图2 裸燕麦谷蛋白酶解物清除自由基能力

2.2 超滤分离后各组分清除自由基活性比较

裸燕麦谷蛋白水解物经超滤获得＞30、10～30、5～10、3～5 ku和＜3 ku的5个分子质量肽段的组分，将这5种组分的蛋白质酶解物质量浓度分别调整到3 mg／mL测定·OH清除率，重复3次，结果如表1所示。从表1可知，分子质量30 ku以上的组分Ⅰ对·OH清除能力最强，而分子质量＜3 ku的肽段清除能力最弱。这与Eun－Kyung等［14］对厚壳贻贝酶解物的研究结果相似，研究认为经超滤得到分子质量30 ku以上的组分·OH清除能力最强。但与一些研究者得出的分子质量＜3 ku的肽段具有更强的·OH清除活性不同［3，8］。

表1 超滤分离后谷蛋白酶解物各组分的羟自由基清除活性

2.3 离子交换层析纯化

将超滤得到的组分Ⅰ用醋酸氨（pH 4.5）溶解后，上样到732强酸型阳离子柱进行分离，结果如图3所示，组分Ⅰ被进一步分离成 A、B、C、D 4个组分。其中组分A的保留时间最短，说明不容易被阳离子树脂吸附，表明这部分肽段组成是酸性氨基酸。而组分D的保留时间最长，容易被阳离子树脂吸附，这说明组分D是碱性氨基酸［15］。

图3 离子交换层析分离纯化组分Ⅰ的结果

2.4 离子交换层析纯化后各组分清除自由基能力比较

离子交换层析纯化后的各组分清除·OH活性的结果如图4所示，组分D的清除率最强，其清除·OH的 IC50值为1.532 mg／mL，而组分 A清除·OH的IC50值为2.399 mg／mL，组分C和组分 B清除能力不强。

图5为各组分清除DPPH·活性结果，组分D清除DPPH·的IC50值为1.278 mg／mL，而组分A清除DPPH·的IC50值为2.098 mg／mL，组分D的清除活性仍比组分A强，组分C和组分B清除能力相对较弱。通过离子交换层析推测组分D是碱性氨基酸，一般认为，碱性氨基酸比中性和酸性氨基酸具有更强的抗氧化性。如 Chen等［3］从大豆蛋白水解物中分离出来的 VNPHDHQN、LLPHH、LVNPHDHQN、LLPHHADADY和 LNSGDALRVPSGTTYY等肽段。Tsuge等［16］从蛋清水解物中分离出来的 AH、VHHANEN和VHH等肽段，都发现碱性氨基酸具有更强的抗氧化性。

图5 离子交换纯化后各组分DPPH·清除能力

2.5 裸燕麦谷蛋白酶解物、离子交换各分离组分清除自由基能力比较

由表2可知，对·OH和DPPH·的清除作用顺序均表现为：分离组分D＞分离组分A＞谷蛋白酶解物。

表2 裸燕麦谷蛋白酶解物及其分离组分的IC50／mg／mL

3 结论

3.1 采用超滤法分离裸燕麦谷蛋白酶解物，得到组分Ⅰ清除·OH的能力最强。其质量浓度为3 mg／mL的·OH清除率达90%。组分Ⅰ的分子质量在30 ku以上。

3.2 选用强酸型阳离子树脂732对组分Ⅰ分离结果显示，组分D是碱性氨基酸，其清除·OH的能力（IC501.532 mg／mL）大于酸性组分 A（IC502.399 mg／mL），组分 D清除 DPPH·的能力（IC501.278 mg／mL）也大于组分A（IC502.098 mg／mL）。表明碱性组分具有较强抗氧化活性。

3.3 通过离子交换层析纯化获得的组分D清除·OH与DPPH·能力较裸燕麦谷蛋白酶解粗提物清除作用都有大幅度提高，因此进一步明确组分D的分子质量大小和肽的氨基酸序列是本研究亟待深入的问题。

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Purification of Free Radical Scavenging Peptides from Naked Oats Glutelin by Enzymatic Hydrolysis

Ma Sarina1Zhang Meili1Fu Yuan2Wuyundalai1Siqinqimuge1

（College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University1，Huhehaote 010018）（College of Sciences，Inner Mongolia Agricultural University2，Huhehaote 010018）

Naked oats glutelin has been hydrolyzed by alkaline protease in the paper.Ultrafiltration and ionexchange column chromatography have been utilized to isolate and purify the naked oats glutelin peptide.The results showed that hydroxyl free radical scavenging activity of component I was the strongest among the total 5 components detected by ultrafiltration separation process.On condition of the mass concentration of 3 mg／mL，scavenging effect against·OH reached a higher value of more than 90%.Component I was further purified into 4 fractions by ion－exchange column chromatography.Fraction D showed a higher scavenging effect against·OH（IC501.532 mg／mL），DPPH·（IC501.278 mg／mL）than the other 3 fractions.Moreover，fraction D was basic amino acids，which had exhibited a higher scavenging effect against hydroxyl and a better DPPH eliminating radical ability than that of the naked oats glutelin hydrolysates.

naked oats，glutelin，enzymatic hydrolysis，purification，free radical

TS217.1

A

1003－0174（2015）09－0045－04

内蒙古自然科学基金（2013MS1221），国家自然科学基金（30960240），内蒙古自治区研究生科研创新资助项目（B20131012911）

2014－04－10

马萨日娜，女，1984年出生，博士，农产品加工及贮藏工程

张美莉，女，1966年出生，教授，博士生导师，植物生物活性成分的分离提取及农产品加工