核桃蛋白有限酶解增溶改性的工艺研究

沈敏江 王文辉 刘 丽 刘红芝 王 强

（中国农业科学院果树研究所1，兴城 125100）（中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室2，北京 100193）

核桃蛋白有限酶解增溶改性的工艺研究

沈敏江1，2王文辉1刘 丽2刘红芝2王 强2

（中国农业科学院果树研究所1，兴城 125100）（中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室2，北京 100193）

为充分利用核桃榨油后的核桃粕，研究了核桃蛋白有限酶解增溶改性的工艺，以拓宽核桃蛋白在食品工业中的应用范围，提高产品附加值。通过比较不同蛋白酶对核桃蛋白的水解度和氮溶指数的影响，筛选出胰蛋白酶为最佳用酶。在单因素试验基础上，通过二次回归正交旋转组合试验对胰蛋白酶有限酶解核桃蛋白的工艺加以优化。结果表明，最佳酶解工艺条件为：液料比10∶1，酶解温度43℃，酶解时间52 min，酶用量0.4%。最佳条件下制备的改性核桃蛋白的水解度仅为3.25%，而氮溶指数从8.74%显著提升到78.16%。

核桃蛋白 蛋白酶 有限酶解 溶解性 工艺优化

核桃是世界上广泛分布的树生坚果，具有很高的营养和经济价值。2011年世界核桃产量为340万t，其中我国占总产量的48.36%，居世界首位［1］。核桃仁中含有66.9%的油脂和16.33%的蛋白质，油脂中富含的不饱和脂肪酸对人体健康尤其重要［2］。核桃蛋白中的8种必需氨基酸比例合理，其中谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸的含量明显高于其他氨基酸，对人体生理作用具有重要的功能［3］。我国的核桃主要用于榨油，而榨油后核桃饼粕大部分用作饲料，很少用于食品加工中，附加值低。核桃粕中蛋白质量分数高达56%，核桃蛋白主要由谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白组成，分别占总蛋白的70.11%、17.57%、6.81%、5.33%［4］。由于核桃蛋白中大部分为谷蛋白，导致其在水中的溶解性特别差，严重限制了其在食品中的应用。因此，通过一定的技术手段来提高核桃蛋白的溶解性是十分必要的，充分利用我国丰富的核桃蛋白资源，促进核桃榨油工业的副产物利用，提高产品附加值。

许多物理、化学、酶解等方法均能用于改变蛋白质的结构和功能特性［5－7］，其中酶解增溶改性因其条件温和、操作简单等优点，近年来得到了广泛的应用［8－10］。有限的蛋白酶水解作用能使蛋白质大分子表面的疏水基团降解，将包裹在分子内部的亲水基团暴露出来，从而使蛋白质的水溶性显著提高［11］。但是酶种类的选择不当或水解度过高均会导致苦味的产生，严重影响水解产物的感官品质。因此，选择合适的蛋白酶，控制较低的水解度，同时提高蛋白质的溶解性成为生产工艺中需要解决的技术问题。

本研究以冷榨核桃粕为原料，对有限酶解所用的蛋白酶种类进行了筛选。通过考察酶用量、底物浓度、酶解温度和酶解时间对酶解产物的氮溶指数和水解度的影响，采用二次回归正交旋转组合设计优化有限酶解核桃蛋白的最佳工艺，获得高氮溶指数、低水解度、具有良好感官品质的高水溶性核桃蛋白粉。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

冷榨核桃粕：陕西天玉公司；中性蛋白酶（6.0×104U/g）、胰蛋白酶（2.5×105U/g）：诺维信公司；复合蛋白酶（5.0×105U/g）、风味蛋白酶（2.0×104U/g）、木瓜蛋白酶（5.0×105U/g）：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 主要设备

FDV型粉碎机：台湾佑崎公司；FE20型pH计：瑞士梅特勒－托利多公司；KIELETEC ANALYSISER全自动凯氏定氮仪：瑞士Foss公司；LGJ－25C冷冻干燥机：北京四环公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白酶的筛选

选用复合蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在温度40℃、酶用量0.3%、液料比10∶1和反应时间40 min的条件下，分别测定酶解产物的氮溶指数（NSI）和水解度（DH）。

1.3.2 单因素酶解试验

用粉碎机将冷榨核桃粕粉碎至粒度100目以上制成核桃脱脂粉，称取10 g核桃脱脂粉分散于100 mL的去离子水中，加入0.3 g胰蛋白酶后，水浴40℃恒温振荡反应40 min，待反应结束后，90℃水浴10 min灭酶，冷却到室温后测定水解度。酶解产物冻干后于－20℃保存，用于氮溶指数的测定。改变其中一个反应条件，固定其余条件，分别考察酶用量、液料比、反应温度和酶解时间对氮溶指数和水解度的影响。各因素水平梯度见表1。

表1 单因素试验因子水平表

1.3.3 氮溶指数的测定

精确称量2 g冻干后的酶解产物，分散于去离子水中，定容至50mL。室温下振荡2 h，于4 500 r/min的条件下离心20 min，量取5 mL上清液用凯氏定氮仪测定蛋白质含量，氮溶指数按下式计算：

式中：NSI为酶解产物的氮溶指数/%；N1为5mL上清液中的可溶性氮/mg；N2为2 g样品中的总氮/mg。

1.3.4 水解度的测定

采用pH－Stat法测定［12］，水解度按下式计算：

式中：DH为水解度/%；B为碱液体积/mL；Nb为碱液物质的量浓度/mol/L；α为α－氨基的解离度；MP为底物中蛋白质的质量/g；htot为底物中蛋白质肽键总数/mmol/g蛋白，本研究核桃蛋白取htot＝8.0。

1.3.5 乳化特性的测定

采用 Pearce等［13］的方法。

1.3.6 起泡特性的测定

采用 Booma等［14］的方法。

1.3.7 多因素酶解试验

根据单因素试验结果，设定液料比10∶1，选取温度（X1），时间（X2），胰蛋白酶用量（X3）为影响因子，以氮溶指数（Y）为响应值，设计二次回归正交旋转组合试验（表2），以确定最佳有限酶解工艺。

表2 二次回归正交旋转组合试验因素水平表

1.4 数据处理

试验数据为3个试验样本的平均值，响应面模型回归方程采用SAS 9.1软件进行统计分析和计算，采用Design－Expert8.0.6作因子交互作用的等高线图。

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶种类的筛选

本试验分别选用的5种蛋白酶在中性环境下均具有较高的酶活力。结果如图1所示，核桃蛋白粉有限酶解后较酶解前其溶解性得到了极显著的提高，表明酶解的方法适合于对核桃蛋白粉溶解性的改善。复合蛋白酶和胰蛋白酶对酶解后核桃蛋白的氮溶指数提高较显著，分别达到了68.96%和69.96%，而水解产物的水解度分别为5.54%和2.26%，其中胰蛋白酶的酶解产物具有较低的水解度。由于较高的水解度会导致苦味肽的形成，而高溶解性的核桃蛋白粉酶解产物主要用途是应用于蛋白饮料，苦味会严重损害其在产品中的应用。因此，综合氮溶指数改善效果和水解度因素，选定胰蛋白酶作为核桃蛋白粉增溶改性的最适用酶，并进行下一步试验。

图1 蛋白酶种类对氮溶指数和水解度的影响

2.2 单因素试验

2.2.1 酶用量的确定

以酶用量为0.05%～0.6%，考察酶用量对水解度和氮溶指数的影响，结果表明酶用量从0.05%增加到0.3%，氮溶指数上升较明显，水解度也明显增加，而酶用量继续增加到0.6%时，氮溶指数上升的幅度明显减少并趋于稳定（图2），表明当酶用量在0.3%以内时，底物没有被酶饱和，增加酶用量可以使底物充分地参与反应。而酶用量超过0.3%后，氮溶指数没有明显增加，水解度却有明显增加，表明过多的酶用量不但不能使氮溶指数升高，反而使可溶性的酶解产物继续被酶解，从而导致水解度升高且产生苦味肽。因此，确定0.3%酶用量为酶解增溶改性单因素最佳条件。

图2 不同酶用量对核桃蛋白酶解产物的氮溶指数和水解度的影响

2.2.2 底物浓度的确定

从图3中可以看出，随着液料比从6∶1增加到10∶1，酶解产物的氮溶指数逐渐增加，液料比继续增加到16∶1时，氮溶指数基本保持不变并逐渐减少；而水解度随着液料比的增加不断提高，尤其是当液料比大于12∶1时，增加速度明显加快。表明当分散液较浓稠时，蛋白酶与底物的接触不够充分，从而导致氮溶指数和水解度均较低，当分散液稀释到一定程度时，酶与底物充分接触，将不溶性蛋白水解成可溶性蛋白，而继续稀释会使可溶性蛋白继续水解成小分子的肽，形成的部分疏水性肽导致氮溶指数逐渐下降。因此，确定液料比10∶1为本试验的最佳单因素条件。

图3 不同液料比对核桃蛋白酶解产物的氮溶指数和水解度的影响

2.2.3 酶解温度的确定

由图4可知，随着酶解温度从30℃增加到40℃，酶解产物的氮溶指数增加，表明相对较高的温度能使蛋白酶的活力得到充分发挥，而随着温度继续上升到70℃，酶解产物氮溶指数逐渐下降，而水解度却随着温度上升逐渐增加，表明过高的温度会提高体系内分子运动的激烈程度，增加蛋白酶和底物的碰撞几率，从而使蛋白水解速度加快，过度的水解还会产生不溶性的肽。因此，为了在较低水解度的前提下提高水解产物的氮溶指数，确定单因素最佳温度为40℃。

图4 不同温度对核桃蛋白酶解产物的氮溶指数和水解度的影响

2.2.4 酶解时间的确定

试验考察了10～60 min内不同酶解时间对产物的氮溶指数和水解度的影响。从图5中可以看出，随着酶解时间从10 min增加到40 min，酶解产物的氮溶指数随之显著增加，说明蛋白酶需要一段时间才能相对充分的与蛋白质作用，从而达到较好的增溶效果。而随着酶解时间继续增加到60 min，氮溶指数的增加逐渐缓慢，水解度的增加也趋于平缓，因为酶切位点逐渐减少，酶的活力也逐渐下降，导致氮溶指数和水解度增长缓慢。因此，确定单因素最佳酶解时间为40 min。

图5 不同酶解时间对核桃蛋白酶解产物的氮溶指数和水解度的影响

2.3 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，选定胰蛋白酶作为核桃蛋白粉有限酶解增溶改性用酶，同时确定液料比为10∶1，设定响应面优化的三因素分别为酶解温度、酶解时间和酶用量。二次回归正交旋转组合设计试验结果和回归分析见表3～表4。

为考察各因子对核桃蛋白酶解产物的氮溶指数的影响，以氮溶指数为指标，对表3数据进行回归拟合，得到三因子与酶解产物的氮溶指数的回归方程：

表3 二次回归正交旋转组合设计试验及结果

表4 方差分析

从方差分析结果（表4）可以看出，回归方程显著性检验F1值为272.01（P＜0.000 1），表明回归方程拟合度达到极显著水平。失拟性检验F2值为1.57（P＝0.412 6＞0.05），差异不显著，表明回归方程无失拟因素存在。且回归模型相关系数R2＝0.998 0，说明模型成立且可靠。由因子方差分析可知，酶解温度（X1）、酶解时间（X2）和酶用量（X3）对 NSI的影响均较大（P＝0.000 5、0.000 1和0.000 1＜0.05），其中温度与酶用量，时间与酶用量之间存在显著的交互作用（P＜0.01）。剔除α＝0.05显著水平不显著项后，简化后的回归方程如式（4）：

通过对方程（4）中的X1、X2、X3求偏导，得出X1＝0.290，X2＝0.598，X3＝0.601，即以 NSI为指标有限酶解核桃蛋白粉的最佳工艺条件为酶解温度42.90℃，酶解时间51.96 min，酶用量0.42%。

由二次回归方程及图6中响应面的等高线图分析可知，酶用量与温度、时间的交互作用对核桃蛋白酶解产物的氮溶指数有显著影响，而温度和时间的交互作用不显著。拟合的等高线图能直观地反应各因素的交互作用对响应值的影响，图6中极高值对应2个因素在另1个因素0水平时的酶解产物氮溶指数最大值。在酶解温度和酶用量对氮溶指数的交互作用中，当温度较低时，随酶用量增加，氮溶指数呈上升趋势，而当温度较高时，随酶用量的增加，氮溶指数先增加较快，后趋于平缓且有所下降；在酶解时间和酶用量对氮溶指数的交互作用中，当时间较短时，随着酶用量的增加，氮溶指数迅速增加，而当酶解时间较长时，随酶用量的增加，氮溶指数增加较缓慢，当酶用量处于较高水平时，氮溶指数反而下降。与单因素试验相比较，各个因素对酶解产物氮溶指数的影响趋势基本一致，二次回归方程的模拟情况基本能够反映实际。

图6 因子交互作用的等高线图

2.4 优化条件验证试验

在理论最佳条件酶解温度42.90℃，酶解时间51.96 min，酶用量0.42%的基础上，验证响应面优化的可靠性，将工艺参数修正为液料比10∶1，酶解温度43℃，酶解时间52 min，酶用量0.4%，此时的NSI的预测值为78.57%。按照修正参数进行3次重复的核桃蛋白有限酶解验证试验，得到核桃蛋白粉酶解后的NSI实际值为（78.16±1.49）%与模型预测值78.57%相符，可用于实际操作。

2.5 有限酶解对核桃蛋白功能特性的影响

以响应面优化后的工艺参数制备有限酶解改性核桃蛋白粉，测定了改性后核桃蛋白的乳化特性、起泡特性等功能特性，结果如表5所示。从表5中可以看出有限酶解改性对核桃蛋白的其他功能特性也有显著的影响，这是由于蛋白质的溶解性会影响其他功能特性，一般情况下，具有较好溶解性的蛋白质也会有较好的其他功能特性［15］。改性后核桃蛋白粉的乳化性有明显的提高，而乳化稳定性却显著降低，这可能是由于有限酶解会导致蛋白质结构的打开，使非极性基团暴露在蛋白分子表面，同时生成的小部分肽会停留在油滴表面使乳化液的稳定性下降［16］。改性后核桃蛋白粉的起泡性和起泡稳定性均有极显著的提高，这是由于有限酶解后形成的可溶性大分子多肽链具有较高的表面活性［17］。

表5 有限酶解改性后核桃蛋白的乳化特性和起泡特性

3 结论

以冷榨核桃粕为原料，经超细粉碎后获得核桃脱脂粉，选择胰蛋白酶作为改性用酶对其进行有限酶解增溶改性。通过单因素试验确定胰蛋白酶增溶改性核桃蛋白的工艺条件为：液料比10∶1，酶解温度40℃，酶解时间40min，酶用量0.3%；采用二次回归正交旋转组合设计确定了胰蛋白酶有限酶解核桃蛋白的最佳工艺为液料比10∶1，酶解温度43℃，酶解时间52 min，酶用量0.4%，在此最佳条件下制备的核桃蛋白水解产物的氮溶指数达到78.16%，同时其水解度经测定仅为3.25%，没有形成苦味等不良感官品质，保持了核桃蛋白粉固有的特征风味。本研究使核桃蛋白粉的氮溶指数从8.74%显著提升到78.16%，其乳化特性和起泡特性也得到了明显的改善，且操作简单、条件温和、成本低廉，使核桃蛋白的应用不再受到水溶性差的限制，大大拓展了其在食品工业中的应用范围。

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Process of Sulobilization and Modification of Limited Enzymatic Hydrolysis from Walnut Protein

Shen Minjiang1，2Wang Wenhui1Liu Li2Liu Hongzhi2Wang Qiang2
（Institute of Pomology，Chinese Academy of Agricultural Sciences1，Xingcheng 125100）（Key Laboratory of Agro－Products Processing，Ministry of Agriculture，Institute of Agro－Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences2，Beijing 100193）

In order tomake full use of thewalnutmeal after extraction ofwalnut oil and broaden the application range in the food industry ofwalnut protein，the process of sulobilization andmodification of limited enzymatic hydrolysis from walnut protein was studied to increase the product additive value.The effect of different enzymes on the degree of hydrolysis（DH）and NSIwere compared，and trypsin was used to limited hydrolyzewalnut protein as the best enzyme.On the base of single factor experiments，the optimum conditions of limited enzymatic hydrolysiswere evaluated by quadratic regression orthogonal rotational combing design.The results showed that the optimum conditions were ratio of liquid to solid of 10∶1，enzymolysis temperature of 43℃，enzymolysis time of 52 min and dosage of trypsin of 0.4%.Under the optimum conditions，the DH ofmodified walnut protein was as low as3.25%，while the NSIofwalnut protein was significantly improved from 8.74%to 78.16%.

walnut protein，protease，limited hydrolysis，solubility，optimization of process

TQ432.2

A

1003－0174（2015）08－0093－06

国家科技支撑计划（2011BAD27B00）

2014－03－10

沈敏江，男，1986年出生，硕士，粮油加工与功能食品

王强，男，1965年出生，研究员，粮油加工与功能食品