结肠息肉癌变过程中内镜微血管特征与MVD IGF-1 STAT3表达相关性研究*

2015-12-20刘红吴静林香春刘揆亮马艳会余瑞金

中国肿瘤临床 2015年10期

刘红吴静林香春刘揆亮马艳会余瑞金

·临床研究与应用·

刘红吴静林香春刘揆亮马艳会余瑞金

目的：分析MVD、IGF-1、STAT3等血管生成因子在结肠癌及癌前病变组织中的表达与窄带成像内镜（NBI）下的微血管形态的相关性，探究内镜实时观测血管生成的可行性。方法：将普通白光内镜以及NBI内镜均诊断为结肠息肉样病变并经病理组织学证实的结肠早期癌、结肠腺瘤纳入研究，将微血管形态分为三型：Ⅰ型：无微血管形态可见；Ⅱ型：微血管沿腺管开口排列，粗细均匀；Ⅲ型：微血管粗细不均，排列紊乱。同时将病变组织进行CD34、IGF-1、STAT3免疫组织化学染色，比较NBI微血管形态特征和组织学结果的相关性。结果：共有58例患者的64个部位（结肠早期癌15个，腺瘤29个，正常黏膜20个）进行NBI内镜检查，NBIⅡ型部位以腺瘤为主，占82.1%（23/28），而早癌多表现为Ⅲ型，占66.7%（10/15）。免疫组织化学提示微血管密度（MVD-CD34）、IGF-1在正常黏膜、结肠腺瘤和结肠早癌中的表达有显著性差异（P<0.000 1，P=0.006 2），STAT3在三者间表达有逐渐增高的趋势（P=0.071 3）。在NBI微血管形态分型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型组织中MVD-CD34、IGF-1、STAT3的表达均有显著性差异（P< 0.000 1，P=0.001 0，P=0.005 5）。NBI的微血管类型和MVD、IGF-1、STAT3表达的相关系数分别为0.67、0.41和0.40。结论：根据NBI内镜实时微血管形态评估组织血管生成，是一项非常有前景的结肠息肉癌变检测方法。

窄带成像内镜结肠腺瘤结肠早期癌微血管形态肿瘤血管生成

结肠癌在我国发病率日益增高，其发生发展与血管生成有密切的关系，有研究提示肿瘤血管生成开关位于癌前病变阶段［1］，测定微血管密度（mi⁃crovessel density，MVD）是评价血管生成的常用指标，胰岛素样生长因子1（IGF-1）、信号转录子与转录活化子3（STAT3）等可促进血管生成［2-4］。另一方面，近年内镜的发展使得内镜下观察血管生成成为可能，窄带成像内镜（narrow band imaging，NBI）可在内镜下清晰显示黏膜表面微血管形态。本研究旨在分析MVD、IGF-1，STAT3等在结肠癌及癌前病变组织中的表达与NBI下的微血管形态的相关性，探究内镜实时观测血管生成的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 一般临床资料将2011年8月至2011年12月在首都医科大学附属北京世纪坛医院消化内镜室就诊，普通白光内镜以及NBI内镜均诊断为结肠息肉样病变并经病理组织学证实的结肠早期癌、结肠腺瘤纳入研究，同时将查体患者并结肠镜检查阴性的患者纳入研究。所有患者均有行内镜下息肉活检、高频电切除或外科手术指征。溃疡性结肠炎、家族性腺瘤性结肠息肉病、锯齿状腺瘤以及进展期结肠癌均除外。所有患者均于内镜检查前签署内镜检查知情同意书。本研究已通过首都医科大学附属北京世纪坛医院伦理委员会批准。

1.1.2 仪器所有入选病例均行NBI结肠镜（CFH260，Olympus Corp，Tokyo，Japan）检查。处理器型号为CV-260SL（Olympus），高清显示器，分辨率为1280×1024，双带NBI过滤器（415 nm和540 nm），有构造强调（A1-A5）和轮廓强调（B1-B5）。

1.2 方法

NBI内镜检查前准备同普通结肠镜检查。白光模式进镜至回盲部，通过辨认阑尾孔、Y型盲肠皱襞和回盲瓣结构，以及进镜至末端小肠证实进镜到达盲肠。退镜观察全结肠，对息肉以NBI模式仔细观察其表面微血管形态，然后行活检、EMR、ESD或外科手术切除病变。结肠黏膜正常者在直乙交界处取活检1块作为对照。标本用甲醛固定后石蜡包埋，以4 μm厚度连续切片，H&E染色进行组织病理学检查，同时进行血管内皮细胞标记物CD34、IGF-1、STAT3（一抗购自武汉博士德生物公司）免疫组织化学染色（步骤按说明书进行）。病理学诊断采用WHO诊断标准。组织学由两位不知内镜结果的病理医师分别确诊。

1.2.1 免疫组织化学结果判断 CD34定位于血管内皮细胞包膜和胞质，其标记的微血管密度（MVD）的计数标准参照Weidner等［5］的方法。对IGF-1和

STAT3蛋白染色片进行半定量分析，选取染色均匀的肿瘤区，在400倍视野下计数着色细胞占细胞总数的比例，共计数5个视野，取平均值。以着色细胞占视野细胞总数的比例计为0～3分：无阳性细胞为0分；<25%为1分；26%～50%为2分；>50%为3分。

1.2.2 NBI图像微血管形态的评价在本研究中，微血管形态分为三型：Ⅰ型：无微血管形态可见；Ⅱ型：微血管沿腺管开口排列，粗细均匀；Ⅲ型：微血管粗细不均，排列紊乱（图1）。记录每个息肉在内镜下微血管类型，并与相应的免疫组化结果对比，分析两者间的相关性。

图1 NBI内镜下微血管形态分型Figure 1 NBI microvascular types

1.3 统计学分析

采用SAS统计分析软件包（9.10；SAS Institute Inc.，Cary，NC）进行。所有计量资料以x±s表示，P<0.05为有显著性差异。MVD、IGF-1和STAT3在各组间表达的差异采用单因素方差分析，然后用SNK进行两两比较。内镜分型与病理结果之间的相关性分析采用非参数Spearman's等级相关分析。

2 结果

2.1 一般情况

共有38例患者的44个结肠病变以及正常结肠20个部位纳入研究。患者的平均年龄是61.5（30～89）岁，其中男性36例，女性28例。44个病变中包括15个结肠早期癌和29个结肠腺瘤，低级别上皮内瘤变19个，高级别上皮内瘤变10个，管状腺瘤14个，绒毛管状腺瘤14个，绒毛状腺瘤1个；肿瘤平均大小1.44 cm，结肠早期癌1.87 cm，结肠腺癌1.06 cm。病变的组织学类型和内镜下表现具体见表1。

2.2 病变NBI类型与病理组织学类型的关系

根据NBI分型，64个部位中，I型25个，其中正常部位20个和腺瘤5个；NBIⅡ型28个，包括腺瘤23个和早期癌5个；在11个NBIⅢ型部位中有10个为早期癌部位，1个为腺瘤。结果提示Ⅱ型部位以腺瘤为主，占82.1%（23/28），而早期癌多表现为Ⅲ型，占66.7%（10/15，表2）。

2.3 不同组织中MVD、IGF-1和STAT3的表达

MVD在正常黏膜、结肠腺瘤和结肠早期癌中的表达数分别为8.77±2.67、21.37±4.42和21.33±5.23，前者与后二者之间有显著性差异（P<0.000 1），在结肠腺瘤和结肠早期癌中无统计学差异（P>0.05），提示MVD在腺瘤中明显增加。IGF-1在正常黏膜、腺瘤和早期癌中的表达分别为0.50±0.76、0.59±0.68和1.27± 0.80，前二者与后者间有显著性差异（P=0.006 2），IGF-1在癌组织中表达明显升高。STAT3在正常黏膜、腺瘤和早期癌中的表达分别为0.40±0.60、0.66± 0.90和1.07±0.96，三者间表达虽有逐渐增高的趋势，但差异无统计学意义（P=0.071 3）。MVD、IGF-1和STAT3在不同组织中的表达见图2，表3。

图2 CD34、IGF-1、STAT3在不同组织中的表达Figure 2 Expression levels of CD34,IGF-1,and STAT3 in colorectal cancer,adenoma,and normal mucosa

表1 结肠病变的组织学类型和内镜下表现Table 1 Histological type and endoscopic type of colorectal lesions

表2 NBI类型与组织学特性的关系Table 2 Correlation between NBI type and histological findings

2.4 病变微血管特征与组织学MVD计数及IGF-1、STAT3表达的关系

在NBI微血管形态分型中，25个Ⅰ型部位的MVD计数为10.85±5.20，28个Ⅱ型部位为21.46± 4.21，11个Ⅲ型部位为22.09±5.84，三者间有显著性差异（P<0.000 1）。Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型部位的IGF-1表达分别为0.44±0.71、0.68±0.67、1.45±0.82，三者间有显著性差异（P=0.001 0）。Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型部位的STAT3表达分别为0.32±0.57、0.75±0.93、1.27±0.90，三者间有显著性差异（P=0.005 5）。对NBI的微血管类型与MVD计数行相关性分析，结果显示Spearman相关系数为0.67，提示两者之间有相关性，即随着内镜下观察到的血管从无到有，颜色从浅到深，MVD计数有逐渐升高的趋势。Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型与IGF-1、STAT3表达具有相关性，相关系数分别为0.41和0.40。以上结果提示内镜下血管形态与IGF-1、STAT3表达的相关性较差，内镜下微血管形态较难反映促血管生成因子IGF-1、STAT3的表达（表4）。

表3 结肠早期癌、腺瘤和正常黏膜中MVD、IGF-1和STAT3的表达Table 3 Expression levels of MVD,IGF-1,and STAT3 in early colorectal carcinoma,adenoma,and normal mucosa

表4 NBI内镜病变微血管特征与组织学MVD计数及IGF-1、STAT3表达的关系Table 4 Correlation of NBI types with expression levels of MVD,IGF-1,and STAT3

3 讨论

血管生成在肿瘤的诊断及治疗中有重要作用，并且有研究提示在癌前病变阶段有血管生成的突然增加。NBI内镜技术为体内实时观察血管生成状态提供了可能。本研究提示在NBI内镜下观察到的结肠息肉微血管形态变化与组织学中检测到的血管生成指标呈正相关，即随着内镜下息肉表面微血管由无到有，颜色由浅到深，对应血管生成由少到多，组织中血管生成因子表达由弱到强，预示在内镜下可实时观察病变血管生成状态的可行性。

NBI内镜下微血管形态分型与组织学结果有显著相关性，与前期研究结果相符合［6］。Ⅰ型即内镜下看不到微血管提示正常结肠黏膜或增生性息肉，Ⅱ型表现为微血管沿腺管开口排列并且粗细均匀，此微血管形态与结肠腺瘤相关［7-8］，微血管粗细不均、排列紊乱的Ⅲ型提示早期结肠癌，此结果与大多数国内外研究结果一致［9-11］。

本研究中，采用CD34标记血管内皮免疫组织化学方法检测MVD，结果提示结肠腺瘤和结肠早期癌中MVD明显高于正常黏膜，提示MVD在腺瘤中明显增加。已有大量研究提示，MVD的增加依赖于血管生成因子的水平［12］，IGF-1是生长调节素的一种，可促进肿瘤血管生成［13］，而STAT3是多种血管生成信号传导通路的一个重要的交汇点［14-15］。本研究提示IGF-1和STAT3的表达与MVD有相似趋势，在正常黏膜、腺瘤和早癌中表达逐渐增高。IGF-1在结肠腺瘤中无明显增加，在早期癌中明显升高，提示IGF-1在正常黏膜→腺瘤→癌序列中表达与MVD的增加可能有不同步的趋势，在MVD增加的早期可能有其他促血管生成因子的参与。

在内镜下微血管形态与血管生成指标关系的研究中，NBI分型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型的部位之间MVD、IGF-1、STAT3表达均有显著性差异，NBI的微血管类型和MVD的相关系数为0.67，提示两者之间有相关性，即随着内镜下观察到的血管从无到有，颜色从浅到深，MVD计数有逐渐升高的趋势。Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型与IGF-1、STAT3表达具有相关性，相关系数分别为0.41和0.40，提示内镜下微血管形态较难反映促血管生成因子IGF-1、STAT3的表达。由以上结果证明内镜下观察到的血管形态可反映组织中微血管密度的状况，但与IGF-1、STAT3等促血管生成因子的表达相关性稍差。

本研究中未选择连续的患者入组，因为在常规内镜检查的患者中，增生性息肉和管状低级别瘤变息肉较多，为便于观察癌变过程中内镜微血管和组织学变化的关系，本研究中刻意多选择了部分腺瘤，尤其高级别瘤变者。另外，内镜微血管形态的变化与选取的促血管生成因子表达相关性稍差，在后续的研究中应寻找其他相关因子，在大样本中进一步深入研究。

总之，本研究提示用NBI内镜实时观察微血管形态评估组织血管生成，是一项非常有前景的检测方法，提示了内镜实时观测血管生成的可行性。

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（2015-03-08收稿）

（2015-04-15修回）

（编辑：杨红欣）

Correlation of microvascular characteristics under narrow band imaging with MVD,IGF-1,and STAT3 expression during cancerization of colorectal polyp

Hong LIU,Jing WU,Xiangchun LIN,Kuiliang LIU,Yanhui MA,Ruijin YU
Department of Gastroenterology,Beijing Shijitan Hospital of Capital Medical University,Beijing 100038,China
This work was supported by funds from the Health System"215"Training Program of High-level Talents in Beijing and Beijing Municipal Project of Health Technical Personnel Training(No.2011D003034000009)

Jing WU;E-mail:wujing36@163.com

Objective:To investigate the correlation between the expression of angiogenic factors(MVD,IGF-1,and STAT3)in colorectal carcinoma and adenoma and the microvascular characteristics under narrow band imaging(NBI),in order to evaluate the feasibility of NBI in real-time observation of angiogenesis.Methods:Patients with pathologically confirmed colorectal polyps were recruited and examined by NBI.Vascular patterns were classified into typeⅠ(invisible or faintly visible),typeⅡ(clearly visible and regularly arranged in a round,oval honeycomb-like pattern),and typeⅢ(clearly visible and irregularly arranged in terms of size and caliber or irregularly winded).Immunohistochemical staining was performed to determine the expression of CD34,IGF-1,and STAT3. Histological results were compared with the vascular patterns under NBI.Results:The NBI endoscopy results of 64 sites(15 adenocarcinomas,29 adenomas,and 20 normal tissues)from 58 patients were introduced and examined in this study.Adenomas ranked the first (82.1%,23/28)among the vascular patternⅡcases,whereas early adenocarcinomas dominated the vascular patternⅢcases(66.7%, 10/15).The expression levels of MVD-CD34 and IGF-1 in normal mucosa,adenomas,and adenocarcinomas were significantly different(P<0.0001 and P=0.0062,respectively).All the expression levels of MVD-CD34,IGF-1,and STAT3 in sites displaying vascular patternsⅠ,Ⅱ,andⅢwere significantly different(P<0.0001,P=0.0010,and P=0.0055,respectively).Spearman correlation coefficients between the NBI vascular patterns and the MVD-CD34,IGF-1,and STAT3 expression levels were 0.67,0.41,and 0.40,respectively. Conclusion:Vascular pattern analysis through an NBI system can be a promising tool to evaluate angiogenesis of colorectal lesions in real-time endoscopic observation.

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