七氟烷对糖尿病相关认知功能下降老年大鼠海马谷氨酸和γ－氨基丁酸的影响

郑晓春，吴桂寿，2，涂文劭，胡 彬，沈石文

2.三明市第二医院 麻醉科，永安 366000；

3.福建医科大学 医学技术和工程学院，福州 350004

糖尿病（diabetes mellitus，DM）可引起体内复杂的代谢机制紊乱，其中枢神经系统的慢性、进展性并发症对认知功能产生影响[1]，被称为DM相关认知 降 低 （diabetes－associated cognitive decline，DACD），表现为空间执行功能、学习和记忆能力受损[2－3]，DM 患者发生 DACD的风险是正常人的1.5倍以上[4]。吸入麻醉剂七氟烷可导致一定程度的术后认知功能障碍[5－6]。本研究观察七氟烷对DACD老年大鼠认知功能的影响和海马神经递质谷氨酸（glutamic acid，Glu）和γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）含量的改变，报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级健康SD大鼠63只，月龄20月，体质量300～400g[福建医科大学动物实验中心，许可证号：SYXK（闽）2012－0002]，雌雄不限。室温（22±2）℃，湿度50%，明暗各12h，适应性饲养3d。通过Morris水迷宫训练并达到“学会标准”（连续20次测试中≥18次正确）[7]。

分组：随机分3组（n＝21）：（1）空白对照组（C组）：普通饲料喂养并排除 DM；（2）DACD 组（D组）：DM＋认知功能下降组；（3）DACD＋七氟烷组（DS组）：在D组的基础上吸入3%七氟烷，余2组吸入100%氧，时长分别为1，2，3h（n＝7）。

1.2 试剂与仪器 七氟烷（250mL，美国Baxter公司），由蒸发器设定输出浓度，载体为O2（100%）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美国Sigma公司），用0.1mol／L 的 柠 檬 酸 缓 冲 液 配 成1%，以25mg／kg腹腔注射。七氟烷挥发罐（美国Abbott公司）；麻醉机（美国Ohmeda公司）；高效液相色谱仪（Agilent 1100，美国安捷伦公司）；Morris水迷宫（中国晟昌公司）；精密电子分析天平（BP21ID，美国Sartorius公司）；多功能监护仪（MP60，荷兰Philips公司）；有机玻璃方仓（0.4m×0.4m×0.6m，自制）。

1.3 方法

1.3.1 DM 模型的制备和鉴定 参照文献[8]，大鼠高糖高脂饲料（10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、1.0%胆酸盐、66.5%普通鼠饲料）喂养至第4周末，禁食12h，腹腔缓慢注射1%STZ，第3d测空腹血糖，如＞16.7mmol／L则认定为模型建立。

1.3.2 水迷宫测试评估学习和记忆能力 参照文献[3]，DM老年大鼠饲料不变，继续饲养至第16周末。Morris水迷宫水池直径1.8m，水深0.35m，水温（24±2）℃。水下平台直径0.1m，高0.3m，水中加入脱脂奶粉使之不可见。摄像机记录动物位置、运行速度和运动轨迹。实验第1～4d为定位航行试验（学习功能），每天将大鼠分别从4个象限面向池壁置入水中3次，记录入水至找到站台的时间为逃避潜伏期。第1d为游泳训练，若2min内未找到站台，则将大鼠引导至站台，逃避潜伏期记为2min，检测完成后取第2～4d逃避潜伏期的平均值。第5d为空间探索实验（记忆功能），去除站台，所有大鼠从固定位置面向池壁置入水中，记录其在2min内在各象限内的游泳时间，计算在站台所在象限游泳时间占4个象限游泳时间的百分比（Tp／T）。全部实验结束后第6d复查Morris水迷宫，观察实验后的记忆能力改变。

1.3.3 七氟烷吸入 麻醉机气体流量计控制氧气流量3L／min，七氟烷蒸发罐控制输出浓度3%，多功能监护仪监测方仓内七氟烷浓度和大鼠脉搏氧饱和度（SpO2），若SpO2＜97%立即移出方仓脱离麻醉剂吸氧，SpO2＞99%再重新开始实验。

1.3.4 海马Glu及GABA含量测定 参照文献[9－11]，大鼠处死后快速断头剥离海马，电子天平称质量（精确到0.1mg），加入2mL甲醇匀浆后取1mL离心，1 500r／min×5min。取上清100μL，加入衍生化试剂100μL，震荡混匀反应2min后，取100μL测定Glu和GABA含量。衍生化试剂：20.01mg邻苯二甲醛，超声溶于500μL甲醇，加入500μLβ－巯基乙醇和9mL硼砂缓冲液（pH＝10.0）。色谱柱：Eclipse XDB C18（4.6mm×150mm，5μm）。流动相：A 液为 0.1mol／L Na2HPO4·12H2O－NaH2PO4·2H2O 缓 冲 液（pH＝6.8）；B液为甲醇；A液／B液＝6∶4。检测波长：激发光波长345nm，发射光波长455nm，流速1mL／min，柱温25℃，进样5μL。将各氨基酸同内标的峰面积比值和各自浓度作标准曲线，测定含内标样品的待测氨基酸与内标峰面积比值，求出样品中2种氨基酸浓度。

Glu和 GABA含量（μg／g）＝[样品浓度（μg／mL）×样品溶解体积（mL）]／样品重量（g）

2 结 果

2.1 空腹血糖的变化 3组血糖基础值（0周）无差异，C组正常饲养16周内空腹血糖均正常，排除DM。D组、DS组高糖高脂饲养4周后体型肥硕，与C组比较，血糖增高，差别有统计学意义（均为P＜0.05）；注射STZ后至16周均出现拒食、体型瘦弱，与4周时比较，血糖均显著增高，差别有统计学意义（P＜0.01），D组和DS组间差别无统计学意义（表1）。

表1 3组大鼠16周内空腹血糖的比较Tab 1 Fasting blood glucose mmol／L

2.2 水迷宫学习记忆能力 D组、DS组均出现逃避潜伏期延长、Tp／T百分比降低，与C组比较，差别均有统计学意义（P＜0.05），提示学习和记忆能力均下降。DS组吸入七氟烷后逃避潜伏期延长、Tp／T百分比下降更明显，与C、D组比较，差别均有统计学意义（P＜0.05）；吸入3h改变幅度加剧，与吸入1，2h比较，差别均有统计学意义（P＜0.05），提示七氟烷对DACD老年大鼠的认知能力进一步降低，且和时间相关（表2）。

2.3 海马Glu和GABA含量 D组和DS组Glu含量下降，GABA含量上升，Glu／GABA比值降低，与C组比较，差别均有统计学意义（P＜0.05）；随着气体吸入时间的增加，DS组的Glu含量明显下降，GABA含量明显上升，Glu／GABA比值明显降低，与D组比较，差别均有统计学意义（P＜0.05），吸入3h后的比值仅为1h时的1／2，组内比较差别有统计学意义（P＜0.01，表3）。

3 讨 论

近年来研究发现，STZ诱导后DM大鼠的学习能力明显减退，持续高血糖可以导致认知功能障碍[12]，证实了在STZ诱导的DM大鼠模型上这是一个危险因素。研究发现，DM至少存在某些方面的认知功能障碍，特别是空间执行功能、学习、记忆能力受损[2－3]。本研究以高糖高脂饲养联合STZ建立了DM模型。Morris水迷宫实验是研究动物空间学习和记忆功能的经典方法，其中逃避潜伏期可客观反应大鼠的学习能力，而Tp／T可反映大鼠的记忆能力。DACD大鼠逃避潜伏期明显延长，Tp／T百分比明显降低[13]。本实验通过水迷宫测试筛选出DACD老年大鼠模型。

表2 大鼠逃避潜伏期和Tp／T的比较Tab 2 Escape latency and raito of Tp／T

表3 3组大鼠海马Glu、GABA含量及Glu／GABA比值的比较Tab 3 The contents of Glu and GABA and the raito of Glu／GABA in hippocampus

七氟烷是目前临床常用的吸入麻醉剂，3%的七氟烷反复吸入可导致老年大鼠一过性的认知功能障碍[5－6]。DACD老年人麻醉前已有认知功能降低，但不同的七氟烷吸入浓度和吸入时间对其记忆能力及中枢神经递质的影响尚不明确。有研究测定大鼠七氟烷的肺泡最低有效浓度（mininal alveolar concentration，MAC）为2.4%[14]，其ED99是1.3MAC，即3.12%。因此本研究中选取七氟烷的浓度为3%，以吸入1，2和3h模拟临床中不同的麻醉时长。

海马作为中枢神经系统中边缘系统的一部分，和学习、记忆以及空间定位功能密切相关，是影响记忆形成的重要部位，神经元、神经胶质细胞及其缝隙连接都参与其中[15]。Glu和GABA作为中枢神经系统具有代表性的一对兴奋性和抑制性神经递质，也分布于海马记忆形成的通路上，影响着记忆的形成。研究表明，学习记忆功能与长时程增强作用（long－term potentiation，LTP）有关，其主要依赖于NMDA受体[7]。Glu与NMDA受体结合时，可开放Ca2＋通道或Na＋通道，形成兴奋性突触后电位，出现长时程增强，从而提高学习记忆功能；同时，GABA可致C1—内流，抑制长时程增强的形成，从而降低学习记忆功能。因此，兴奋性Glu水平降低、抑制性GABA水平升高、Glu／GABA比值降低会导致学习记忆功能降低。本研究中DACD大鼠Glu、GABA与空白对照组差异不大，但七氟烷组Glu下降明显，GABA显著上升，Glu／GABA比值下降，其中吸入3h后变化更大，Morris水迷宫测试也证实了其记忆能力下降，提示七氟烷影响海马突触中兴奋性－抑制性神经递质的平衡，进一步抑制DACD老年大鼠的认知功能。Irifune等也认为，麻醉药物主要是通过兴奋或抑制中枢神经系统不同位点的突触通路而产生效应，对突触传递的抑制是全身麻醉的共同特性，直接或间接受体功能的抑制已被推测为麻醉作用的最后共同通路[16]。

综上所述，长时间1.3MAC七氟烷吸入麻醉可进一步降低DM相关认知下降大鼠的记忆能力，其机制可能与七氟烷改变Glu和GABA平衡有关。

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