携带肝细胞生长因子的腺病毒感染脐带间充质干细胞的实验研究

张玉镇 娄季宇△ 杨霄鹏 曾志磊 王珊珊 刘新珊 张晓明 尹红蕾 王运良

1）郑州大学第二附属医院神经内科 郑州 450014 2）解放军第一四八中心医院神经内科 淄博 255300 3）解放军第一五九中心医院神经内科 驻马店 463000

近年来，细胞移植治疗帕金森病（Parkinson’s disease，PD）已吸引许多研究者的关注［1］，而人脐带间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord，hUC-MSC）因具备较多的优点已成为优先修复PD的种子细胞之一［2］。同时肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）作为一个多功能的生长因子，参与多种细胞的分化、增殖、再生、迁移及形态的发生，包括hUC-MSC［3］。据Salehi等［4］报道，HGF可能参与了帕金森病的病理生理过程。因此，将hUC-MSC和HGF结合可能会成为治疗PD的一种新型方法。

本研究将hUC-MSC分离并鉴定后，感染携带肝细胞生长因子基因的腺病毒载体（adenoviral vector carrying HGF gene，Ad-HGF），观察hUC-MSC内酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和多巴胺转运体（Dopamine transporter，DAT）的表达情况，以明确在HGF过表达的情况下，hUCMSC是否有类多巴胺神经元分化的潜能，为HGF基因修饰hUC-MSC治疗PD提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒毒株Ad-GFP由美国百特医疗用品公司基因治疗部提供，携带HGF的重组腺病毒毒株Ad-HGF由本室构建；脐带组织取自我院住院的健康产妇，所有标本的获得均经产妇知情同意，并经医院伦理委员会批准。F12培养基购自美国Gibco公司。DA ELISA试剂盒购自德国IBL公司。所有的抗体均购自美国R＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSC分离培养和鉴定：足月健康新生儿脐带用无血清F12培养基清洗残余血液，挑出脐动静脉后，将剩余组织剪成约2mm的组织块，再转至离心管中，用无血清培养基清洗数遍以去除脐带组织表面的黏液，后转移至25cm2的培养瓶中，添加10%胎牛血清和双抗的F12培养基，置于细胞培养箱中5%CO2，37℃培养，待细胞从组织块周围爬出进行传代培养，只取3～6代细胞用于实验。

将细胞用无血清培养基洗涤3次后，胰酶消化制成细胞悬液（1×106mL-1），取0.1mL加入每个离心管中，再加入CD44、CD29和CD105一抗，并在黑暗条件下4℃孵育30min；然后加入荧光标记的二抗，同样条件下孵育30min。甲醛溶液固定后，用流式细胞仪（Becton Dickinson公司）和CellQuest软件分析细胞表面是否表达CD44、CD29和CD105。

1.2.2 重组腺病毒转染hUC-MSC后转染效率的测定：将hUC-MSC接种于6孔细胞培养板中，每孔5×105个细胞，待细胞生长融合至80%左右，吸出原来的培养液，用无血清无双抗的F12洗涤3遍，分别加入MOI为50、100、150、200和400的Ad-GFP，以F12做为对照，2h后弃掉病毒液，换成完全培养基继续培养，48h后收取细胞用流式细胞仪检测转染效率。

1.2.3 细胞免疫酶化学方法检测TH和DAT的表达：将无菌盖玻片置于细胞培养板内，Ad-HGF感染细胞不同时间点，将玻片取出；磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3×2min；4%多聚甲醛处理（室温）20min；PBS漂洗3×2min；0.5%Txiton X-100处理（室温）20min；PBS漂洗3×2min；3%H2O2处理15min；试剂盒中的血清封闭液，37℃封闭20min；取出甩干封闭液后加一抗，阴性对照用PBS代替一抗，37℃1～2 h或4℃过夜；PBS漂洗3×2min；加生物素标记的二抗37℃孵育30min；PBS漂洗3×2min；DAB显色2～10min，苏木素复染观察。

1.3 统计学分析 使用SPSS 10.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析，所有数据以均值±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。免疫组化结果运用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件进行分析，得到集成光学密度值（IOD）值后再进行统计学比较。

2 结果

2.1 hUC-MSC分离培养及鉴定 采用组织块法分离hUCMSC，组织块贴壁后3～4d后可见少数细胞从组织块周围爬出，细胞呈梭形，多角形，可见细胞核，随着细胞增殖，形状逐渐转向典型的成纤维样细胞。当细胞融合至90%左右，细胞呈平行排列或漩涡状。然后按1︰2将细胞传代。取第3代用流式细胞仪检测细胞分子表面标志。如图1所示，分离培养出的hUC-MSC表达间质干细胞表面标志物CD29、CD44和CD105，而不表达内皮细胞标志CD31和造血细胞表面抗原CD45。

图1 流式细胞仪检测hUC-MSC表面CD44、CD29和CD105的表达情况

流式细胞仪结果表明hUC-MSC表达间质干细胞分子表面标志CD44、CD29和CD105，而不表达内皮细胞标志CD31和造血细胞表面抗原CD45。

2.2 重组腺病毒可高效感染hUC-MSC 运用不同MOI（50、100、150、200和400）的Ad-GFP感染hUC-MSC，48h后流式细胞仪和荧光显微镜检测感染效率。结果显示随着MOI值的升高，感染效率逐步提高，当MOI为200时感染效率就能达到99.55%左右，但当MOI值为400时，感染效率也只有99.99%（图2）。本研究结果表明，我们构建的腺病毒可高效感染hUC-MSC。本着细胞损伤小，所用腺病毒少，还要高感染效率的原则，接下来的实验中腺病毒感染MOI值统一为200。

图2 流式细胞仪检测hUC-MSC感染效率

不同MOI（0、50、100、150、200和400）的Ad-GFP感染细胞后继续培养48h。流式细胞仪检测感染效率。随着病毒滴度的变化感染效率可达99.99%。但MOI 200和400组间无明显差异。

2.3 Ad-HGF感染后hUC-MSC细胞内TH和DAT表达逐渐增加 hUC-MSC感染Ad-HGF后，连续观察3d，如图3所示，hUC-MSC内TH和DAT的表达逐渐增多，随着时间的推移，这种现象越来越明显，同时发现细胞形态逐渐改变，转为多边形和不规则形，还会看到有长的突起。对免疫组化结果进行图像分析，随机选取10个视野得到IOD值，再进行统计学分析（图3），结果表明对照组和Ad-HGF组间差异有统计学意义（P＜0.01）。

图3 细胞免疫酶化学方法检测hUC-MSC感染Ad-HGF后TH和DAT的表达

hUC-MSC感染Ad-HGF后，随着时间的推移，细胞内TH和DAT的表达逐渐增多，同时细胞形态逐渐改变，转为多边形和不规则形，还会看到有长的突起（如箭头所示，左边是TH，右边是DAT，从上而下依次为0、3、7、10d）。

图4 图像分析软件分析细胞免疫酶化学结果

对细胞免疫酶化学结果进行图像分析，随机选取10个视野得到IOD值，再进行统计学分析，结果表明对照组和Ad-HGF组间有显著性差异（＊P＜0.01，A：TH，B：DAT）。（图4）。

3 讨论

hUC-MSC治疗PD成为目前比较感兴趣的话题，证据表明，hUC-MSC移植进入患者体内后表现出很强的可塑性，一定条件下，可分化成多种功能细胞。越来越多的资料证实，细胞因子、免疫和炎症反应的产物，在帕金森病发生发展的过程中起非常重要的作用［5］。HGF作为一种多功能的生长因子，对运动神经元的发育、存活、轴突的生长和导向，以及对周围神经损伤后神经元的保护、轴突的延长和神经纤维的修复等具有重要作用［6］。Lan等［7］发现，HGF可调控多巴胺能神经祖细胞的增殖和迁移，为治疗帕金森综合征提供新的思路。日本学者用6-羟多巴胺制作大鼠的帕金森模型，单侧纹状体内注射携带HGF基因的质粒，并与注射lacZ基因的质粒相对照，24周时HGF组症状明显减轻，且与剂量有关。免疫组化结果发现对照组约90%的多巴胺能神经元消失，而HGF组仅减少70%左右，提示HGF过表达可以阻止帕金森大鼠多巴胺能神经元的死亡［8］。Salehi等［4］运用免疫印迹方法检测PD和正常人脑脊液及血液中的HGF，发现2组血液中HGF浓度无明显差异，而PD患者脑脊液中HGF的浓度远高于正常人群，表明HGF参与了PD的病理生理过程。

外源性HGF蛋白在体内半衰期短，不易通过血脑屏障。构建含HGF基因的腺病毒载体可直接用于感染靶细胞，转染宿主细胞后，外源基因至少持续表达2周，同时不整合入宿主细胞。因此，Ad-HGF与hUC-MSC结合将是修复PD的一种新型方法。本研究中，我们将Ad-HGF转移到hMUMSCs中，重点观察hMU-MSCs向多巴胺能样细胞分化的情况。结果表明，hMU-MSCs感染Ad-HGF后逐步表达TH和DAT。同时还发现，hMU-MSCs的形状在慢慢改变，从长梭形向多角形，而且还有一些长的突起，类似于对神经干细胞的形态，提示hUC-MSC在HGF的作用下具有向多巴胺能样神经元分化的能力，为HGF基因修饰hUC-MSC治疗帕金森病提供一定的细胞基础。

［1］Sharma R，McMillan CR，Niles LP.Neural stem cell transplantation and melatonin treatment in a 6-hydroxydopamine model of Parkinson＇s disease［J］.J Pineal Res，2007，43（3）：245-254.

［2］Can A，Balci D.Isolation，culture，and characterization of human umbilical cord stroma-derived mesenchymal stem cells［J］.Methods Mol Biol，2011，698（1）：51-62.

［3］Bot taro DP，Rubin JS，Falet to DL，et al.Identification of hepatocyte growth Factor receptor as the c-met proto-oncogene product［J］.Science，1991，251（2）：802-804.

［4］Salehi Z，Rajaei F.Expression of hepatocyte growth factor in the serum and cerebrospinal fluid of patients with Parkinson＇s disease［J］.J Clin Neurosci，2010，17（12）：1 553-1 556.

［5］Fiszer U.Does Parkinson＇s disease have an immunological basis The evidence and its therapeutic implications［J］.BioDrugs，2001，15（6）：351-355.

［6］Hu ZX，Geng JM，Liang DM，et al.Hepatocyte growth factor protects human embryonic stem cell derived-neural progenitors from hydrogen peroxide-induced apoptosis［J］.Eur J Pharmacol，2010，645（1／3）：23-31.

［7］Lan F，Xu J，Zhang X，et al.Hepatocyte growth factor promotes proliferation and migration in immortalized progenitor cells［J］.Neuroreport，2008，19（7）：765-769.

［8］Koike H，Ishida A，Shimamura M，et al.Prevention of onset of Parkinson＇s disease by in vivo gene transfer of human hepatocyte growth factor in rodent model：a model of gene therapy for Parkinson＇s disease［J］.Gene Ther，2006，13（23）：1 639-1 644.