卡培他滨联合不同归经引经药抗乳腺癌肺转移疗效研究

刘玲琳 徐海滨 胡祖健 何俊玲 杨慧芬 刘胜⋆

卡培他滨联合不同归经引经药抗乳腺癌肺转移疗效研究

刘玲琳 徐海滨 胡祖健 何俊玲 杨慧芬 刘胜⋆

目的 探讨卡培他滨联合不同归经引经药（桔梗、川牛膝）对小鼠4T1乳腺癌肺转移模型中原位瘤、肺转移灶的疗效差异。方法 建立Balb/c小鼠4T1乳腺癌肺转移模型，随机分为桔梗组、川牛膝组、卡培他滨+桔梗组、卡培他滨+川牛膝组、卡培他滨组（西医阳性药对照）和空白对照组。绘制各组给药期间原位瘤体积生长曲线，给药结束后比较各组瘤重、瘤重抑制率及肺转移情况。结果 各药物组在给药中后期对4T1小鼠原位瘤均有一定的抑制作用。给药结束后，与对照组比较，卡培他滨、卡培他滨+桔梗、卡培他滨+川牛膝组差异均有统计学意义（P＜0.05），其中与单药卡培他滨组比较，卡培他滨+桔梗组抑瘤作用更强（P＜0.05）。在瘤重和瘤重抑制率方面，与对照组比较，仅卡培他滨+桔梗组差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。在肺转移方面，卡培他滨+川牛膝组显示出一定的促进作用，余组均显示出不同程度的抑制作用。与对照组比较，卡培他滨组与卡培他滨+桔梗组差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），且后者抗肺转移作用更佳。结论 与单药卡培他滨比较，卡培他滨联合桔梗可进一步抑制4T1荷瘤小鼠原位瘤及肺转移灶的发生发展，而卡培他滨联合川牛膝在原位瘤抑制方面弱于单药卡培他滨，在肺转移方面则观察到有促进作用，提示卡培他滨配伍不同归经引经药（桔梗、川牛膝）在乳腺癌特异性肺转移中存在疗效的差异性和靶器官的选择性。

乳腺癌 肺转移 引经药 桔梗

肺转移是乳腺癌最常见的内脏转移之一，乳腺癌肺转移是乳腺癌治疗中的重点和难点［1］。本研究通过观察卡培他滨联合不同归经引经药（桔梗、川牛膝）在4T1乳腺癌特异性肺转移模型中的疗效差异，以期为中医药抗乳腺癌肺转移的临床实践提供实验依据。报道如下。

1 材料和方法

1.1 动物 Balb/c小鼠60只，雌性，18g左右，由中国科学院上海实验动物中心提供，动物订购至上海中医药大学实验动物中心后，无特定病原体（SPF）环境饲养，常规饮水，饲料供应，饲养1周后开始实验。

1.2 细胞株及细胞培养 小鼠4T1乳腺癌细胞株购自ATCC，由上海中医药大学科技实验中心保存，培养于含10%胎牛血清、100 Unit/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基，37℃培养箱培养。

1.3 实验用药及试剂仪器 （1）药物：桔梗、川牛膝（购自上海养和堂中药饮片有限公司），卡培他滨片（希罗达）（上海罗氏制药有限公司）。（2）试剂及仪器：RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国Gibco）；Bouin固定液：苦味酸饱和液（1.22%）75ml、福尔马林25ml、冰醋酸5ml；HF1200 A2型生物安全柜（力新仪器上海有限公司）；XDS-B型倒置显微镜（重庆光电仪器有限公司）；3110 Thermo型 CO2培养箱（美国热电）；Milli-Q超纯水系统（美国Millpore）；HISTOSTAT-820切片机（美国RMC）；EVOS大屏幕数码倒置显微镜 （美国AMG）；NIKON 4500数码相机（日本NIKON）。

1.4 乳腺癌肺转移动物模型建立 取对数生长期体外培养的小鼠4T1细胞株（肺高转移潜能），采用无血清的RPMI 1640培养基调整单细胞悬液浓度为1×107/ ml。无菌条件下，接种于Balb/c小鼠右侧第二乳头的脂肪垫上，接种量为0.1 ml/只（细胞数为1×106/只）。1.5 分组与给药 共分6组，分别为桔梗组、川牛膝组、桔梗+卡培他滨组、川牛膝+卡培他滨组、卡培他滨组（西医阳性药对照）和空白对照组。实验动物原位瘤长径至2mm后，随机分组，每组10只，给药剂量按人鼠等效剂量换算，给药周期4周。

1.6 观察指标 （1）给药期间瘤体积生长曲线：给药期间，每4d予游标卡尺测其原位瘤长、短径，计算瘤体积，公式如下：V=1/2ab2（a为长径，b为短径）。（2）瘤重、瘤重抑制率：给药结束后，称量裸鼠体重后脱颈处死裸鼠，摘除肿瘤、剔除筋膜，记录瘤重、计算瘤重抑制率，公式如下：瘤重抑制率（%）=［（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重］×100%。（3）肿瘤肺转移评价：①肺脏病理切片制作与评价：每组随机选6个肺组织（右肺）经生理盐水冲洗后，置于10%福尔马林液中固定。经不同浓度酒精逐级脱水、石蜡包埋、连续切片，制成4μm切片，苏木精、伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下摄影，并评价肿瘤转移情况及其它可见的病理改变。②肺结节定量：每组随机选8个肺组织（右肺）经生理盐水冲洗后，置于Bouin固定液中。固定1周后，样本正常肺组织呈黄色，肺部结节（肿瘤转移灶）不被染色呈白色，根据结节的大小（直径）与数量进行评分：1分为＜1mm，2分为1mm，3分为2mm，4分为≥3mm。统计每个样品的评分总数，评价肿瘤转移情况。

1.7 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 给药期间各组实验动物原位瘤体积变化 各药物组在给药中后期对4T1荷瘤小鼠原位瘤均有一定的抑制作用。给药结束后，与对照组比较，卡培他滨组、卡培他滨+桔梗祖、卡培他滨+川牛膝组差异均有统计学意义（P均＜0.05）。与单药卡培他滨组比较，卡培他滨+桔梗组显示出更好的抑瘤作用（P＜0.05），提示“引经上行”中药桔梗与卡培他滨协同使用，可提高卡培他滨的抗癌活性。见图1。

2.2 原位瘤实体形态 见图2。

图1 给药期间各组4T1乳腺癌原位瘤体积变化

图2 各组原位瘤实体形态

2.3 瘤重 给药结束后，与对照组比较，只有卡培他滨+桔梗组在瘤重方面差异明显（P＜0.05），提示桔梗配伍卡培他滨比单药卡培他滨抑瘤作用好，见图3。

图3 各组瘤重

2.4 瘤重抑制率 在瘤重抑制率方面，各药物组对原位瘤均有一定程度的抑制作用，但仅卡培他滨+桔梗组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图4。2.5 肺脏病理 见图5。

图4 各组瘤重抑制率

图5 4T1乳腺癌肺转移模型各组肺转移灶病理

2.6 肺结节定量 在4T1荷瘤小鼠肺转移方面，卡培他滨+川牛膝组显示出一定的促进作用。余药物组均显示出一定的抑制作用，其抑制肺转移作用由低到高依次为：牛膝组、桔梗组、卡培他滨组、卡培他滨+桔梗组。其中与对照组比较，卡培他滨组与卡培他滨+桔梗组差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），且卡培他滨+桔梗组抑制肺转移作用优于单药卡培他滨组，见图6。

图6 各组肺转移结节数

3 讨论

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，已居我国城市女性恶性肿瘤发病率首位［2，3］。肺转移是乳腺癌最常见的内脏转移之一，目前现代医学针对乳腺癌肺转移的治疗采用以化疗为主的综合治疗，如何进一步提高乳腺癌肺转移的临床疗效是医学界持续探讨的热点问题。

本研究选择中医学药物桔梗为引药上行的肺经经典引经药，《本草求真》中论述“桔梗系开肺气之品，可为诸药舟楫，载药上浮”，具有引药入肺，提高疗效的作用。现代药理研究发现，桔梗具有抗炎镇痛、祛痰镇咳、降脂降糖、抑制胰酶活性、改善胰岛素抵抗、促进胆酸分泌、抗肿瘤及免疫调节等广泛的生物学活性［4～6］。桔梗水提物或甲醇提取液具有较强的抗癌活性［7］。而桔梗皂苷是良好的表面活性剂，能增加其他药物的吸收［8］。川牛膝则具有引药下行的作用，《寒温条辨》中有云“牛膝，生用其性下走如奔，破血症，通经闭，引诸药下行”，现代药理研究显示，牛膝多糖能显著提高S180荷瘤小鼠脾细胞诱生杀伤细胞（LAK）活性和肿瘤坏死因子β（TNF-β），具有广泛杀伤肿瘤细胞和异质细胞的能力，且与化疗药物环磷酰胺有协同抗肿瘤作用［9］。研究发现，川牛膝多糖能增强正常小鼠特异性和非特异性免疫功能，并对环磷酰胺导致的白细胞数量减少具有一定的减毒作用［10］。本资料选用川牛膝作为桔梗的中医药对照，比较卡培他滨联合桔梗或川牛膝在抗乳腺癌特异性肺转移治疗中是否存在疗效的差异性和靶器官的选择性。

本资料结果显示，各药物组在给药中后期对4T1荷瘤小鼠原位瘤均有一定的抑制作用。给药结束后，与对照组比较，卡培他滨组、卡培他滨+桔梗祖、卡培他滨+川牛膝组均显示出一定的抑瘤抗癌活性。而与单药卡培他滨比较，卡培他滨联合引药上行中药“桔梗”后可进一步提高4T1荷瘤小鼠原位瘤及肺转移灶的抑制作用。而卡培他滨联合引药下行中药“川牛膝”在原位瘤抑制作用方面弱于单药卡培他滨，在肺转移方面观察不仅无抑制作用，而且具有促进肺转移的作用。而单味药桔梗和川牛膝比较，川牛膝在4T1荷瘤小鼠原位瘤的抑制作用优于桔梗，而桔梗在肺转移抑制方面则优于川牛膝，提示卡培他滨配伍不同归经引经药（桔梗、川牛膝）在乳腺癌特异性肺转移中确实存在疗效的差异性和靶器官的选择性。本研究从实验角度佐证中医引经药及归经理论在中医药抗乳腺癌及转移性乳腺癌治疗中的科学性和合理性。

在抗乳腺癌转移有效的西药卡培他滨基础上联合肺经引经药桔梗可进一步提高抑制4T1荷瘤小鼠原位瘤及肺转移发生发展的作用，为抗乳腺癌肺转移有效复合制剂的研发提供思路和方法，从而为中医药防治乳腺癌肺转移的临床治疗提供新的选择。在此基础上，进一步深入研究卡培他滨联合桔梗发挥良好抗乳腺癌肺转移作用的可能机制是值得继续研究的方向。

1 Andre F, Slimane K, Bachelot T, et al． Breast cancer with synchronous metastases: trends in survival during a 14-year period． J Clin Oncol, 2004, 22(16): 3302～3308．

2 郑莹,吴春晓,张敏璐．乳腺癌在中国的流行状况荷疾病特点．中国癌症杂志,2013,23(8):561～569．

3 赵平, 陈万青, 孔灵芝． 中国癌症发病与死亡2003-2007．北京: 军事医学科学出版社,2012．121．

4 付文卫,窦德强,裴月湖．桔梗的化学成分和生物活性研究进展．沈阳药科大学学报,2006,23(3):184～189．

5 武博,刘萍．桔梗的现代研究进展．中国药物应用与检测,2008,5(2): 48～50．

6 郭文杰,许旭东,魏建和,等．桔梗中三萜皂苷类化学成分研究进展．中国药学杂志,2008,43(11):801～804．

7 Choi C K,Kim J Y,Kim Y S,et al．Augmentatation of macrophage functions by an aqueous extact isolated from Platycodon grandiflorun．Cancer Lett, 2001,166(1):17～25．

8 中国医学科学院药物研究所编．中草药现代研究(第二卷)．北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1996．202．

9 余上才,章育正．牛膝多糖抗肿瘤作用及免疫机制实验研究．中华肿瘤杂志,1995,17(4):275～278．

10 王剑,付田,浦蔷,等．川牛膝多糖的体内免疫活性研究．中药药理与临床．2007,23(6):31～33．

Objective To observe the different efficacy of capecitabine plus different meridian-guiding herbs（platycodon grandiflorum、radix cyathulae）for the treatment of lung metastasis from breast cancer in vivo. Methods Establishment of 4T1 breast cancer lung metastasis Balb/ c mice model.60 mice were randomly assigned to 6 groups：platycodon grandiflorum、radix cyathulae、capecitabine plus platycodon grandiflorum、capecitabine plus radix cyathulae、capecitabine and control group. Description of tumor growth curve during the administration，calculation of tumor weight、inhibition rate of tumor weight and quantitative analysis of inhibition in lung metastasis. Results Capecitabine、 capecitabine plus platycodon grandiflorum and capecitabine plus radix cyathulae groups indicated some degree of inhibition effect in tumor growth（P＜0.05），capecitabine plus platycodon grandiflorum played a better inhibition in primary tumor compared with capecitabine（P＜0.05）.Only capecitabine plus platycodon grandiflorum demonstrated efficacy at tumor weight and inhibition rates of tumor weight compared with control group（P＜0.05）.Capecitabine plus radix cyathulae group promoted lung metastasis，while other groups inhibited lung metastasis compared with control group（P＜0.05，P＜0.01）. Conclusion Capecitabine plus platycodon grandiflorum played a better inhibition both in primary tumor and lung metastasis，while capecitabine plus radix cyathulae showed weaker suppression in primary tumor and promoted lung metastasis compared with control group. The study indicated that capecitabine plus different meridian-guiding herbs showed different inhibition efficacy in lung metastasis of breast cancer.

Breast cancer Lung Metastasis Meridian-guiding herb Platycodon grandiflorum

浙江省中医药科学研究基金计划（2011ZB113）；杭州市科技局项目（20110733Q28）；杭州市卫生局项目（2011Z015）

310007杭州市中医院乳腺外科（刘玲琳 徐海滨 胡祖健 何俊玲 杨慧芬）

200032上海中医药大学附属龙华医院乳腺外科（刘胜）

*通讯作者