17—β—雌二醇对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚的影响

肖红卫　华再东　张立苹　任红艳　刘西梅　华文君　李莉　毕延震　郑新民

摘要：为了观察17-β-雌二醇对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚的影响，选用屠体卵巢上的卵母细胞為试验材料，将其分为4组，分别在培养基中添加 0、25、50、75 μmol/L 17-β-雌二醇，体外成熟培养时间为36～44 h，受精胚培养时间为9 d。结果表明，在培养基中分别添加17-β-雌二醇0、25、50、75 μmol/L时猪卵母细胞体外成熟率分别为58.5%、67.1%、80.9%、64.5%，卵裂率分别为51.2%、56.5%、63.5%、59.2%，囊胚形成率分别为16.7%、24.2%、19.5%、24.0%。结果显示在培养基中添加50 μmol/L 17-β-雌二醇可提高猪卵母细胞体外成熟率至80.9%，提高体外受精胚的卵裂率至63.5%，但囊胚形成率以添加量为25 μmol/L的组最高，说明添加17-β-雌二醇可提高猪卵母细胞成熟率、卵裂率以及囊胚率。

关键词：17-β-雌二醇；卵母细胞；体外成熟；体外受精；胚胎培养

中图分类号：S828.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）22-5660-02

Abstract： For observing the effect of 17-β-E2 on the porcine oocytes maturation and fertilized embryos development in vitro， the porcine oocytes collected from prepubertal gilts ovaries were cultured in maturation medium which added different concentration 17-β-estrodiol （0、25、50、75 μmol/L） for 36～44 hours. The fertilized eggs were cultured for 9 days. The results showed that the maturation rate of each addition was 58.5%， 67.1%， 80.9%， 64.5%， respectively. The cleavage rate was 51.2%， 56.5%， 63.5%， 59.2%， respectively， and the blastocyst rate was 16.7%， 24.2%， 19.5% and 24.0%， respectively. It indicated that the addition of 17-β-estrodiol could improve maturation rate， cleavage rate and blastocyst rate， and the maturation rate & cleavage rate of 50 μmol/L addition were higher than the other 3 groups， but the blastocyst rate of 25 μmol/L addition was higher than the other groups.

Key words： 17-β-estrodiol；porcine oocytes； in vitro maturation； in vitro fertilization； embryo culture

自Mattiol等[1]用屠体的卵母细胞获试管猪以来，卵母细胞的体外成熟培养已经取得了较大的进展[2]。目前，研究者大多从屠宰场废弃卵巢中获取卵母细胞，但随着中国养猪业的发展，生猪出栏时间从原来的5个月缩短到3个月，而3月龄的母猪尚未性成熟。因此，如何进一步提高卵母细胞的成熟效率，为胚胎工程技术准备更多优良的成熟卵母细胞就日益成为研究者所关注的焦点[3，4]。

雌二醇（E2）是体内主要由卵巢成熟滤泡分泌的一种天然雌激素，能促进和调节性器官及副性征的正常发育，临床用于卵巢机能不全或卵巢激素不足引起的各种症状。本试验在猪卵母细胞的成熟培养基中添加不同浓度的雌二醇，以研究其添加量对卵丘细胞体外成熟率的影响及对体外受精胚发育率的影响，旨在为胚胎工程技术的发展提供参考。

1 材料与方法

除特别标识外，所有试剂均购自Sigma公司，耗材为NUNC公司产品。

1.1 卵巢的采集、运输、清洗及修剪

本试验所用卵巢来自武汉市中粮肉食品加工厂屠宰场。剪下刚屠宰的直径约1.0～2.5 cm、卵泡颜色清亮、形态正常（无过大、病变卵泡）且手感尚温的卵巢（剪去卵巢上附带的输卵管和系膜），放入加有双抗的35～38 ℃的灭菌生理盐水中，在2 h内送回实验室。随后用等温生理盐水冲洗2～3次至无血水。

1.2 卵母细胞的采集

用带有18 G针头的注射器抽取卵巢表面卵泡（2～6 mm），将抽取液注入50 mL离心管（离心管置于38 ℃的水浴锅中）中。待卵丘-卵母细胞复合体（COCs）沉淀后在立体显微镜下检卵。选取带有致密卵丘细胞的卵母细胞并对所得细胞进行分级比较。将检出的COCs用加有双抗的DPBS 洗涤3次，然后用卵母细胞操作液洗涤3次，移入当天上午在CO2培养箱中平衡的成熟培养液中。卵母细胞的培养采用四孔板培养法：每孔400 μL的培养体系内放入80枚卵，在5%CO2、95%空气、38.5 ℃饱和湿度下培养36～44 h。

1.3 卵母细胞体外成熟情况的检查

培养结束后，检查卵丘扩散情况，再将卵母细胞移至0.1%透明质酸酶溶液中，涡漩振荡法脱去卵丘细胞并在显微镜下检查极体排出情况。

1.4 体外受精

将培养成熟的卵母细胞用透明质酸酶除去其外面的卵丘细胞。挑选胞质饱满均匀、有第一极体的卵母细胞移入到預平衡的获能液中洗涤 3～5次。然后用移卵管移入上盖矿物油并在CO2培养箱中预孵1 h以上的受精液微滴中（50 μL），每滴放入10～15枚卵母细胞，置于 CO2培养箱（38.5 ℃、5%CO2、100%饱和湿度）中，等待受精。

将已经获能的精子，调整精子浓度到2×106个/mL左右。然后取50 μL加入到等待受精的卵母细胞微滴中，于CO2培养箱（38.5 ℃、5%CO2、100%饱和湿度）中，共同孵育6 h。

1.5 胚胎培养

受精6 h后，将卵母细胞移入NCSU23中轻轻吹打，去除附着在受精卵周围的精子，并用 NCSU23 洗涤3次，然后放入至少平衡2 h的NCSU23微滴（4 μg/mL BSA）中，每滴约10枚受精卵，培养条件为38.5 ℃、5%CO2、100%饱和湿度。受精当天记为第0天，第二天检查卵裂情况，第六天检查囊胚发育情况。

1.6 试验设计

1.6.1 不同浓度17-β-雌二醇对卵母细胞成熟的影响 用以下配方对卵母细胞进行体外产生培养，36～44 h后，以出现第一极体者（pbⅠ）判为卵母细胞成熟，比较不同雌二醇添加浓度对卵母细胞成熟的影响。

mTCM199配方： TCM-199（Gibco）添加3.05 mmol/L葡萄糖、0.91 mmol/L丙酮酸钠、0.57 mmol/L L-半胱氨酸、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL硫酸链霉素、10%（V/V）卵泡液、10 IU/mL孕马血清促性腺激素（PMSG）和10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素（hCG）。

试验设置4个处理，分别为处理1：mTCM199+0 μmol/L 17-β-E2；处理2：mTCM199+25 μmol/L 17-β-E2；处理3：mTCM199+50 μmol/L 17-β-E2；处理4：mTCM199+75 μmol/L 17-β-E2。

1.6.2 不同雌二醇添加浓度对体外受精胚发育的影响 用NCSU23培养基对体外受精胚进行体外培养，出现卵裂后进行计数，并在出现囊胚后统计囊胚的数量，比较不同雌二醇添加浓度对体外受精胚发育的影响。

2 结果与分析

2.1 不同雌二醇添加浓度对卵母细胞成熟的影响

由表1可见，在成熟液中添加0、25、50、75 μmol/L 17-β-雌二醇的卵母细胞的成熟率分别为58.5%、67.1%、80.9%、64.5%。结果表明，成熟液中添加50 μmol/L17-β-雌二醇可提高卵母细胞的成熟率。

2.2 不同雌二醇添加浓度对体外受精胚发育的影响

由表1可见，在成熟液中添加0、25、50、75 μmol/L 17-β-雌二醇的卵母细胞的体外受精胚卵裂率分别为51.2%、56.5%、63.5%、59.2%；第六天的囊胚率分别为16.7%、24.2%、19.5%、24.0%。表明在培养基中添加50 μmol/L17-β-雌二醇组的卵裂率最高，但在囊胚形成率上以添加25 μmol/L17-β-雌二醇组最高，说明17-β-雌二醇在卵母细胞成熟上起作用，不同浓度的处理对后期胚胎发育的影响不同。

3 小结与讨论

有关雌二醇在卵母细胞成熟中的作用有许多报道，但是对于不同物种得出的结论不一致[5-7]。李凯等[5]研究发现，雌二醇对小鼠卵母细胞的成熟及其发育潜力无明显作用。吕丽华等[6]研究发现，在山羊卵母细胞体外成熟培养中，添加1 μg/mL雌二醇更有利于卵母细胞体外成熟培养，可使卵裂率提高17.6%。李继鹏等[7]研究发现，在基础培养液中添加浓度为2.0 μg/mL的雌二醇可促进犬卵母细胞核成熟到MⅠ-MⅡ期，但效果并不明显。戈力等[8]研究发现，成熟液中添加1 μg/mL雌二醇对猪卵母细胞的体外成熟具有明显的促进作用，而添加100 μg/mL 雌二醇对猪卵母细胞体外成熟具有明显的抑制作用。

本研究发现，添加17-β-雌二醇可提高猪卵母细胞成熟率、卵裂率及囊胚率；但对于受精后的卵裂率，其中以添加50 μmol/L 17-β-雌二醇组效果最好，可促进猪卵母细胞的成熟，提高受精后胚胎的发育能力。

参考文献：

[1] MATTIOLI M，BACCI M L，GALEATI G，et al.Developmental competence of pig ooctyes matured and fertilized in vitro[J].Theriogenology，1989，31（6）：1201-1207.

[2] 秦鹏春，谭景和，吴光明，等.猪卵巢卵母细胞体外成熟与体外受精的研究[J].中国农业科学，1995，28（3）：58-66.

[3] 孟庆刚，张成林，张永忠，等.猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟研究[J].畜牧兽医学报，2001，32（3）：213-219.

[4] 张 涌，刘素娟.山羊小腔卵母细胞的体外成熟培养和体外受精[J].西北农业大学学报，1996（4）：12-16.

[5] 李 凯，赵雁伟，郭 勇，等.雌二醇和孕酮对小鼠卵母细胞体外成熟的影响[J].中国实验动物学报，2008，16（4）：293-297.

[6] 吕丽华，李富忠，岳文斌.成熟液中添加不同浓度雌二醇对山羊卵母细胞成熟的影响[J].黑龙江畜牧兽医，2008（12）：37-38.

[7] 李继鹏，尹熙俊，崔成都，等.雌二醇对犬卵母细胞体外成熟的影响[J].延边大学农学学报，2013，35（2）：152-155.

[8] 戈 力，张运海，陶 勇，等.不同浓度雌二醇对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎的影响[J].畜牧与饲料科学，2011， 32（12）：9-11.

（责任编辑 曾德芳）