T细胞斑点试验对结核性脑膜炎的诊断价值

李君莲 李东军 玛力亚木·古丽比克 刘 艳 杨东奇（通讯作者）

1）新疆自治区胸科医院检验科 乌鲁木齐 830049 2）新疆乌鲁木齐市红十字急救中心 乌鲁木齐 830091 3）新疆喀什地区结核病防治所 喀什 844000

结核性脑膜炎临床症状特异性低，早期定性诊断较困难，结核菌素试验（PPD）是结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染筛查和辅助诊断的经典方法，但其诊断特异性相对较低，多用于MTB 感染的筛查［1］。T 细胞免疫为基础的体外γ-干扰素释放试验（interferon-γrelease assays）被证实在MTB 感染检测中具有较好的特异性和敏感性［2］，其中以检测外周血分泌γ-干扰素（IFN-γ）的T 淋巴细胞数量的T-SPOT．TB 试验是使用最广泛的一种。本研究检测两种技术诊断结核性脑膜炎的临床价值，现报告如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选择我院2012-04—2013-11收治疑似结核性脑膜炎患者230例，男138例，女92例；平均年龄（43．2±8．8）岁。根据临床症状、体征、影像学和（或）细菌学、病理学分等为将入选的患者划分为确诊、可能性大、诊断不明及排除诊断。

1．2 PPD 试验 于患者的前臂掌侧皮内注射结核菌素纯蛋白衍化物（TB-PPD）（北京祥瑞生物制品有限公司生产）0．1 mL（5IU），观察注射72h后的反应情况。参照《中国结核病防治规划实施工作指南》（2008版）［3］评价标准，以硬结直径≥10mm 为阳性结果。

1．3 T-SPOT．TB试验 （1）8mL静脉血枸橼酸钠抗凝，室温保存（18～25℃），1600r／min离心28min；（2）用吸液管吸取白色、云雾状的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）层转移至15 mL 尖底离心管 中，加入细胞培养液至10mL 再600r／min离心7min，弃去上清液用1mL培养液重悬沉淀；（3）加培养液至10mL，350r／min离心7min；（4）弃去上清液加0．7mL培养液重悬沉淀，并孵育过夜；（5）分离的PBMCs放在包被INF-γ抗体的微孔板，加入结核特异性抗原早期分泌靶向抗原A（6-kDa early secreted antigenic target，ESAT-6）和培养滤过蛋白B（10-kDa culture filtrate protein，CFP-10），温箱培养24h，洗去T 淋巴细胞，加入生物素标记的二抗，经酶联显色形成斑点，记录斑点数［3］。根据抗原A 和（或）抗原B孔的反应判断结果，满足以下结果之一者为阳性：（1）如果阴性对照孔斑点数为0～5，则抗原A 或抗原B 斑点数-阴性对照孔斑点数≥6 者为阳性；（2）如果阴性对照孔斑点数≥6，则抗原A 或抗原B斑点数≥2×阴性对照孔斑点数为阳性［4］。

1．4 评价指标 检测的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。

1．5 统计学分析 数据均采用SPSS 19．0 软件包进行分析，计数资料采用McNemar检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

根据患者临床表现、影像学、标本涂片抗酸染色及培养、组织病理学检查等结果，确诊结核53例，诊断为结核病可能性大的患者30例，排除活动性结核病诊断的患者121例，最终诊断不明的患者26例。排除诊断不明的26例患者，对诊断结核病的83例和排除结核病的121例患者进行检验，TSPOT．TB和PPD 的特异度率分别为98．3%和80．2%（χ2＝33．7，P＝0．0）；敏感度为95．2%和56．6%（χ2＝29．4，P＝0．0）。见表1、2。

表1 2种检测方法在不同诊断患者中的检测结果比较

表2 2种检测方法各项统计指标比较

3 讨论

快速、准确诊断活动性结核病对于有效控制结核至关重要。PPD、血清学检查是目前最常用的结核病诊断手段，但特异性欠强，敏感性较低。其他方法还有涂片抗酸染色、结核分枝杆菌培养及组织病理学检查等，但抗酸染色检出率低，结核杆菌培养耗时较长，通常需要2个月，不利于早期诊断与治疗，组织病理学检查常为有创性，也不宜临床普及。IFN-γ释放试验是近十年来开展临床应用的一种诊断结核分枝杆菌感染的技术，其原理是机体受到MTB刺激会产生致敏的T 淋巴细胞，当再次遇到同类抗原时能细胞能产生IFN-γ，该实验就是在体外以MTB 特异性的ESAT-6 和CFP-10作为抗原刺激细胞分泌IFN-γ，通过计数分泌IFN-γ的T 淋巴细胞数量，准确判断机体是否存在结核感染。由于利用的是MTB的特异性抗原，与卡介苗或环境中大多数非结核分枝杆菌不存在抗原交叉，所以特异性大大高于PPD，且不会受到机体免疫状态的影响［5］。

本研究对经传统方法确诊或排除的结核病患者分别进行T-SPOT．TB和PPD 检测，结果表明T-SPOT．TB检测诊断结核性疾病敏感度为95．2%，特异性为98．2%，显著高于临床常用的PPD，显示出优异的诊断效能。而PPD 敏感度为56．6%，特异性为80．2% ，与文献报道相似［6］，也因为其较低的准确度目前PPD 多用于筛查。

虽然T-SPOT．TB已经在世界各国和各大医院广泛使用，但应注意其不足之处：（1）该项技术需合适的仪器以及专门操作人员，技术难度远高于PPD，同时标本的采集、运送、操作技巧均可影响其精确度。（2）试剂盒花费较高，难以在结核病流行的国家和地区推广，批量化生产仍需进一步的努力；（3）T-SPOT．TB只能用于检测机体是否有结核感染［7］。

［1］中华医学会结核病学分会．肺结核诊断和治疗指南［J］．中华结核和呼吸杂志，2001，24（2）：70-74．

［2］Lui G，Lee N，Cheung SW，et al．Interferon gamma release assay for differentiating tuberculosis among pneumonia cases in acute healthcare setting［J］．J Infect，2011，62（6）：440-447．

［3］张瑛，孙亚蒙，徐欣晖，等．结核感染T 细胞斑点试验在结核性疾病中的诊断价值［J］．中华临床医师杂志（电子版），2010，4（12）：2 431-2 434．

［4］张立华，靳文香，贾红彦，等．T-SPOT 与结核菌素试验对结核病患者的临床诊断价值［J］．中华临床医师杂志（电子版），2012，6（14）：4 107-4 108．

［5］Kim SH，Song KH，Choi SJ，et al．Diagnostic usefulness of a T cell-based assay for extra pulmonary tuberculosis in immune compromised patients［J］．Am J Med，2009，122（2）：189-195．

［6］Talbot EA，Harland D，Wieland-Alter W，et al．Specificity of the tuberculin skin test and the T-SPOT．TB assay among students in a low-tuberculosis incidence setting［J］．J Am Coll Health，2012，60（1）：94-96．

［7］Sztajnbok FR，Boecha NL，Sztajnbok DC，et al．The challenge of pediatric tuberculosis in face of new diagnostic techniques［J］．J Pediatr（Rio J），2009，85（3）：183-193．