猪圆环病毒病原生物学研究进展

时 代，潘 玲，杨克礼 ，米显高，米国武(1．湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，动物胚胎与分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉40064;．安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥001;．湖北省鹤峰县兴华畜牧业有限公司，湖北鹤峰445800)

1974年，科学家Tisher等观察几株传代PK-15细胞时在显微镜下发现了一种类似细小病毒的圆形颗粒状粒子，这些小粒子并不导致细胞病变，因此被研究人员认为是一种普通的污染物［1］。直到1982年，Tischer等用超速离心机离心后提取了该病毒粒子，通过电镜观察病毒形态，终于发现这并不是普通的细胞污染物，而是一类没有囊膜的单链环状DNA病毒，并将其命名为猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)。此后，在德国、加拿大、英国、北爱尔兰、新西兰、美国等国家的猪群中PCV抗体血清均检测呈阳性，但人工感染该PCV病毒后并不会造成猪只临床症状和病理上的变化［2－4］。1991年，Clark等在加拿大某些猪场中首次发现1种被称为断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的传染病，被感染的仔猪生长受阻、呼吸急迫、体型也出现消瘦、黄疸、贫血，剖检发现淋巴结肿大、肝脏质地变硬、间质性肺炎。该病在世界范围内迅速蔓延，美国、法国、日本、北爱尔兰、韩国、德国、西班牙、意大利等国家相继发现了PMWS的感染［5－8］。我国有学者于2000年利用ELISA方法检测到了该病的存在［9］。基于此，笔者对PCV病原生物学的研究进展进行了综述，以期为今后开展猪圆环病毒的诊断及防控技术研究提供理论依据。

1 猪圆环病毒的病毒学分类

国际病毒分类委员会(ICTV)在第六次学术报告中新命名了圆环病毒科，其中包括圆环病毒属(Circovirus)、矮缩病毒属(Nanovirus)、环病毒属(Gyrovirus)以及最新定名的一个新属Anellovirus。该科病毒都是由单股圆环状的DNA链组成，无囊膜。圆环病毒科除了常见的猪圆环病毒外，还有鸭圆环病毒(Cuck circovirus，DuCV)、鹅圆环病毒(Goose circovirus，GCV)、鸽圆环病毒(Pigeoncircovirus，PiCV)、金丝雀圆环病毒(Canary circovirus，CaCV)、鹦鹉喙羽病病毒(Beak and feather disease virus，BFDV)、鸡贫血病病毒(Chicken anaemia virus，CAV)等动物病毒。在植物中还发现了椰树叶腐烂病毒(Coconutfoliar decay virus，CFDV)、地三叶草侏儒病毒(Subterranean clover stunt virus，SCSV)、香蕉簇顶病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)等植物病毒［10－13］。PCV 和该属其他不同成员都有2个最大的主要开放阅读框，分别负责编码病毒复制相关的Rep蛋白和病毒的衣壳结构蛋白Cap蛋白;属内成员之间复制相关的蛋白有很高的氨基酸同源性，约为40% ～60%;这2种蛋白都具有环柄序列基元，这与病毒复制的启动有一定的关系［14］。

2 猪圆环病毒的形态结构与理化性质

PCV病毒粒子无囊膜、二十面对称球形，直径14～25 nm，平均直径17 nm［15］，单链闭合结构，是目前为止动物体内发现的最小的病毒之一。PCV病毒粒子是由一条多肽分子链的衣壳蛋白和核酸组成，其中衣壳蛋白分子量大约为3．6×104Da;核酸是一个环状的DNA单链，长度为1 767或1 768 bp［16］。PCV 在 CsCl中浮密度为 1．33 ～1．37 g/cm3，沉降系数约52S。PCV对不良环境有很强的抵抗力，在70℃高温环境中可以生存 15 min［17］，56 ℃ 不能使其失去活性［18］。它可以在pH 3的酸性环境中长时间生存，而不被灭活。一般的消毒剂(如碘酒、酒精等)对其无效，但对氢氧化钠、次氯酸钠、季铵盐混合物、酚混合物的耐受力较弱，相对比较敏感［19］，PCV 不存在血凝作用［20］。

3 PCV的体外培养

PCV可以在PK-15细胞和Vero细胞中生长增殖，在动物的外周血液、肺洗液的单核细胞和巨噬细胞、骨髓、淋巴结中也可以增殖［21］，其最佳的体外培养场所是PK－15细胞，PCV病毒的复制依靠S期的细胞表达蛋白。Tischer等［22］研究发现，用DMEM处理细胞培养物后可以促进病毒在细胞内的复制，并且在细胞内形成包涵体。感染PCV病毒的PK－15培养细胞主要是以胞浆内包涵体的形式存在的，少数感染细胞内还会含有核内包涵体。

4 PCV的分子生物学特征

PCV为环状的DNA分子，只有1条单链，PCV1的全基因组长1 759 bp，其中能够编码蛋白且蛋白大于5 kD的开放阅读框有7个［23］。PCV2的全长为1 767 bp或1 768 bp，通过软件分析其全长序列，判断其中可能含有11个开放阅读框，也有人认为其实只有6个，这些开放阅读框之间大小有很大的差异［24－25］。

同种基因型的PCV基因组有较高的同源性，达到95%，而不同基因型的PCV基因组的同源性只有76%。ORF1位于病毒正链，编码病毒复制相关的Rep蛋白，它的核酸和氨基酸的同源性分别为83%和86%，差异较小。ORF2位于病毒负链，编码病毒的衣壳蛋白Cap蛋白，ORF2的差异较大，核酸和氨基酸同源性分别为67%和65%［26－27］。

在Rep蛋白和Cap蛋白之间有1段111 bp长的DNA(728～838 nt)片段，病毒复制的起始点就在这里，若发生突变将会对病毒的复制产生严重的影响［23］。研究发现，在PCV 2个主要蛋白基因之间有一条回文序列，形成茎环结构(Stem-loop structure)，它的顶部有一保守的九聚体结构(5’-TAGTATTAC-3’)，而CGGCAGCGG/TCAG在这段序列中重复出现了2次，据此可以判断这段序列是启动复制蛋白的结合位点［28］。

5 PCV主要蛋白的研究进展

5．1 Rep蛋白的研究进展 Rep蛋白与病毒的复制有关，由 ORF1编码［29］。PCV1 的 Rep蛋白为 35．6 kD，由 312 个AA组成。PCV2的 Rep蛋白为35．8 kD，由314个 AA组成［24］。ORF1是一个保守的开放阅读框，这就导致不同PCV株的Rep蛋白的抗原性非常接近，氨基酸同源率达86%。正是这个原因导致了2种血清型的PCV之间存在着交叉感染。在Rep基因中存在3个与基因复制相关的保守基序Ⅰ(FTLNN)、Ⅱ(HLQG)、Ⅲ(YCSK)及结合 dNTPs的 P 环(P-loop)结构(序列 G-GKS)［30］。Rep蛋白的功能靠该结构维持，若发生突变或者缺失，都会给病毒的复制造成影响。

Rep蛋白具有很高的保守性，PCV Rep蛋白与植物的Nanovirus和Geminivirus的Rep蛋白同源性很高。根据生物进化规律及物种间亲缘关系分析表明，圆环病毒的Rep蛋白可能是Nanovirus与嵌杯样病毒之类的小RNA病毒的RNA结合蛋白或者原核生物的解旋酶发生了重组的结果［31－33］。据此推断，PCV很有可能是联系动植物病毒之间的一座桥梁。

5．2 Cap蛋白的研究进展 ORF2开放阅读框编码病毒的Cap蛋白，它是由234个氨基酸组成，分子量大小约为28 kD，是病毒入侵细胞之后在细胞内各种酶的作用下形成的病毒的核衣壳，是病毒的结构蛋白［24］。PCV感染细胞后6～12 h可以检测到细胞中Cap蛋白的存在，12 h后可以在细胞核中定位出来［34］。与ORF1有很高的保守性不同，ORF2的变异则较大，不同基因型的PCV ORF2同源性约70%。有研究人员利用软件预测PCV全序列中的抗原位点，发现PCV中存在的抗原位点共有5个，只有一个在ORF1上，其余4个全部位于ORF2中［35］。分析PCV高免血清同Cap蛋白的结合位点发现，在Cap蛋白的第169～183位氨基酸片段中，PCV1与PCV2的Cap蛋白都能与2种基因型的PCV高免血清发生特异性结合，有交叉反应性。在PCV2 Cap蛋白上有3个是针对PCV2血清型的抗原位点，分别位于氨基酸序列的65～87位、112～139位、193～207位，它们只与PCV2高免血清特异性反应，和其他血清型的高免血清没有作用。这表明在Cap蛋白的这3个区域里面有PCV2型特异性的抗原位点，其中112～139位是PCV2感染的特征，可以依此为标志建立血清学方法检测PCV2的感染［36］。有学者在研究PCV单克隆抗体的过程中发现，在PCV的Cap蛋白中存在着一个中和抗原表位［37］。将PCV2 ORF2基因和它的连续缺失产物，与PCV1 ORF2相交换，在PCV1的基础上构建了带有PCV2 ORF2基因片段的PCV1/PCV2重组嵌合病毒。再通过PCV2的特异性单克隆抗体来研究不同类型嵌合病毒的免疫反应性的差别，定位PCV2的Cap蛋白表位，结果表明在PCV2的Cap蛋白的第47～233位的氨基酸序列中，至少存在5个优势表位。在230～233位区域内，PCV2阳性血清和嵌合病毒结合于Cap蛋白氨基酸区域内，分别定位在63～85以及165～185位。在Cap蛋白N端部分含有丰富碱性氨基酸，在装配阶段和DNA结合，这部分氨基酸可能与病毒衣壳的内表面形成有一定的关系［38］。

2001年，Liu等［39］用原核表达系统表达出ORF2基因，并且证明了表达出来的蛋白有很强的免疫原性。也有学者利用真核表达出了PCV ORF2蛋白，通过对表达产物的分析发现，其中至少存在着2个糖基化位点;Western-blot分析表明，表达产物的片段大小和PCV病毒的核衣壳大小十分相近，将该产物纯化染色后在电子显微镜下观察，其形态与PCV病毒粒子非常相似，直径为17 nm，有些颗粒由于中心浓染而类似于空衣壳，结果证实了表达出的蛋白可以在体外环境中组装成病毒样粒子。在细胞中表达的Cap蛋白可以被定位于核周，进一步研究发现其中对定位信号起到决定作用的是12～18和34～41位区域内的碱性氨基酸［40］。用大肠杆菌表达系统表达基因定位域缺失的ORF2 rCap蛋白，结果表明该蛋白的单克隆抗体同样保留Cap蛋白的反应原性，并且同时保持了对PCV2的中和活性［41］。

PCV2毒力的大小与ORF2基因有很大的关系，不同地区分离到的PCV2毒株之所以毒力不同，很可能是由于ORF2基因发生了变异造成的，并且ORF2基因还可能影响病毒在细胞中的增殖滴度。Fenaux等将PCV1和PCV2的ORF2基因互相调换，构建了2株嵌合型病毒，分别是PCV1为基础导入PCV2 ORF2的PCV1-2和以PCV2为基础导入PCV1 ORF2的PCV2-1。在导入PCV1 ORF2置换后，PCV2的毒力大大降低［42］。将PCV2感染PK15细胞，经过120代连续传代后，可以发现病毒的增殖滴度第1代为102．83TCID50/ml，第 120代 病毒的 增殖滴度 可升高 到 103．75TCID50/ml，经过连续传代的病毒的毒力也大大减弱。收集各个代次的病毒，分别将全基因组测序，通过对比发现在120代病毒的ORF2中出现了2个位点的突变，其中1个为110位P变为A，另1个是第191位由R变成S。这说明这2个位点的突变可能造成了病毒毒力的改变。

［1］TISCHER I，RASCH R，TOEHTERMANN G．Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines［J］．Zbn Bakt Hyg Abt Ovig A，1974，226(2):153 －167．

［2］DAFT B，NORDHAUSEN R，LATIMER K S，et al．Interstitial pneumonia and lymphadenophathy associated with circoviral infection in a six weekold pig［J］．Proc Am Assoc Vet Lab Diag，1996，39:32．

［3］SMYTH J A，WESTON J，MOFFETT D A，et al．Detection of circovirus infection in pigeons by in situ hybridization using cloned DNA probes［J］．J Vet Diagn Invest，2001，13(6):475 －482．

［4］ONUKI A，ABE K，TOGASHI K，et al．Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan［J］．J Vet Med Sci，1999，61:1119 －1123．

［5］KENNEDY S，ALLAN G，MCNEILLY F，et al．Porcine circovirus infection in Northern Ireland［J］．Vet Rec，1998，142:495 －496．

［6］CHOI C，CHAE C，CLARK E G．Porcine postweaning multisystemic wasting syndrome in Korean pig:Detection of porcine circovirus 2 infection by immunohistochemistry and polymerase chain reaction［J］．J Vet Diagn Invest，2000，12(2):151 －153．

［7］MANKERTZ A，BUHK H J，BLAESS G，et al．Transcription analysis of porcine circovirus(PCV)［J］．Virus Genes，1998，16(3):267 －276．

［8］TERREGINO C，MONTESI F，MUTINELLI F，et al．Detection of a circovirus-like agent from farmed pheasants in Italy［J］．Vet Rec，2001，149(11):340．

［9］郎洪武，张广川，吴发权，等．断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测［J］．中国兽医科技，2000，30(3):3 －5．

［10］BASSAMI M R，BERRYMAN D，WILCOX G E，et al．Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus，plant circovirus，and chicken anaemia virus［J］．Virology，1998，249(2):453 －459．

［11］NIAGRO F D，FORSTHOEFEL A N，LAWTHER R P，et al．Beak and feather disease virus and porcine circovirus genomes:Intermediates between the geminiviruses and circoviruses［J］．Arch Virol，1998，143(9):1723－1744．

［12］TODD D，CREELAN J L，MACKIE D P，et al．Purification and biochemical characterization of chicken anaemia agent［J］．J Gen Virol，1990，71(4):819－823．

［13］ROHDE W，RANDLES J W，LANGRIDGE P，et al．Nucleotide sequence of a circular single-stranded DNA associated with coconut foliar decay virus［J］．Virology，1990，176(2):648 －651．

［14］MEEHAN B M，CREELAN J L，MCNULTY M S，et al．Sequence of porcine circovirus DNA:affinities with plant circoviruses［J］．J Gen Virol，1997，78:221 －227

［15］殷震，刘景华．动物病毒学［M］．2版．北京:科学出版社，1997:1175－1180．

［16］KIM J，CHOI C，HAN D U，et al．Simultaneous detection of porcine circovirus type 2 and porcine parvovirus in pigs with PMWS by multiplex PCR［J］．Vet Rec，2001，149(10):304 －305．

［17］TISCHER I，GELDERBLOM H，VETTERMANN W，et al．A very small porcine virus with a circular single-stranded DNA［J］．Nature，1982，295(5844):64 －66．

［18］芦银华，陈德胜，戴亚斌，等．应用复合PCR检测猪圆环病毒［J］．中国兽医科技，2001，31(9):8 －9．

［19］ROYER R L，NAWAGITGUL P，HALBUR P G，et al．Susceptibility of porcine circovirus type 2 to commercial and laboratory disinfectants［J］．Journal of Swine Health and Production，2001，96(6):281 －284．

［20］TISCHER I，GEDERBLOM H，VETTERMANN W，et al．A very small porcine virus with circular single-stranded DNA［J］．Nature，1982，295:64 －66．

［21］ALLAN G M，KENNEDY S．Experimental reproduction of wasting disease and death by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine circovirus［J］．Vet Med，1999，36(5):368 －378．

［22］TISCHER I，PETERS D，RASEH R，et al．Replication of porcine circovirus:induction by glucosamine and cell cycle dependence［J］．Arechives of Virology，1987，96:39 －57．

［23］POFRANICHNYY R M，YOON K J，HARMS P A，et al．Characterization of immune response of young pigs to porcine circovirus type 2 infection［J］．Viral Immunology，2000，13(2):143 －153．

［24］HAMEL A L，LIN L L，NAYAR G B，et al．Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs［J］．J Viral，1998，72:5262 －5267．

［25］MANKERTZ A，MUELLER B．Hillenbrand．Replication of porcine cirvovirus type 1 requires two proteins encoded by the viral repet gene［J］．Virology，2001，279(2):429 －438．

［26］MOROZOV I，SIRINARUMITR T，SORDEN S D．Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome［J］．J Clin Microbiol，1998，36:2535 －2541．

［27］NAWAGITGUL P，MOROZOV I，BOLIN S R，et al．Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major Capsid protein［J］．Virology，2001，279(2):429 －438．

［28］MANKERTZ A，MUELLER B，STEINFELD T，et al．New reporter genebased replication assay reveals exchange ability of replication factors of porcine circovirus types 1 and 2［J］．Journal of Virology，2003，77(18):9885 －9893．

［29］MANKERTZ A，MANKERTZ J，WOLF K，et al．Identification of a protein csscntial for the replication of porcine circovinis［J］．Gen Virol，1998，79:381－384．

［30］MANKERTZ A，MANKERTZ J，WOLF K，et al．Identification of a protein csscntial for the replication of porcine circovinis［J］．Gen Virol，1998，79:381－384．

［31］NIAGRO F D，FORSTHOEFEL A N，LAWTHER R P，et al．Beak and feather disease virus and porcine circovirus genomes:Intermediates between the geminiviruses and circoviruses［J］．Arch Virol，1998，143(9):1723 －1744．

［32］HANLEY-BOWDOIN L，SETTLAGE S B，OROZCO B M，et al．Geminiviruese:models for plant DNA replication transcription，and cell cycle regulation［J］．Cirt Rev Biochem Mol Biol，2000，35:105 －140．

［33］ GUTIERRE C．Geminivirirus DNA replication［J］．Cell Mol，Life Sci，1999，56:313 －329．

［34］MEERTS P，MISINZO G，MCNEILLY F，et al．Replication kinetics of different porcine circovirus 2 strains in PK-15 cells，fetal cardiomyocytes and macrophages［J］．Arch Virol，2005，150(3):427 －441．

［35］MAHE D，BLANCHARD P，TRUONG C，et al．Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes［J］．J Gen Virol，2000，81:1815 －1824．

［36］TRUONG C，MAHE D，BLANCHARD P，et al．Identification of an immunorelevant ORF2 epitope from porcine circovirus type 2 as a serological marker for experimental and natural infection［J］．Arch Virol，2001，146:1197－1211．

［37］MCNEILLY F，MCNAIR I，MACKIE D P，et al．Production，characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus 2［J］．Arch Virol，2001，146:909 －922．

［38］LEKCHAROENSUK P，MOROZOV I，PAUL P S，et al．Epitope mapping of the major Capsid protein of type 2 porcine circovirus(PCV2)by using chimeric PCV1 and PCV2［J］．J Virol，2004，78(15):8135 －8145．

［39］LIU Q，WILLSON P，ATTOH P S，et al．Bacterial expression of an immunologically reactive PCV －2 ORF2 fusion protein［J］．Protein Expr Puri，2001，21(1):115 －120．

［40］LIU Q，TIKOO S K，BABIUK L A．Nuclear localization of the ORF2 protein encoded by porcine circovirus type 2［J］．Virology，2001b，20:285(1):91 －98．

［41］ZHOU J Y，SHANG S B，GONG H，et al．In vitro expression，monoclonal antibody and bioactivity for Capsid protein of porcine circovirus type II without nuclear localization signal［J］．J Biotechnol，2005，118(2):201 －211．

［42］FENAUX M，OPRIESSING T，HALBUR P G，et al．Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2(PCV2)and nonpathogenic PCV1 in weanling pigs［J］．J Virol，2003，77(2):11232 －11243．