Hes1与小鼠海马齿状回神经再生*

高 峰张 振康晓魁李 佳李 帆任新亮张利通靳张宁董文涛杨新宇

Hes1与小鼠海马齿状回神经再生*

高 峰①张 振①康晓魁①李 佳①李 帆②任新亮②张利通①靳张宁①董文涛①杨新宇①

目的：观察幼年小鼠与成年小鼠海马齿状回中Hes1的表达差异，初步分析其对成年神经再生的影响。方法：将C57BL/6雄性小鼠分为幼年组（10 d，N组）和成年组（4个月，A组），每组8只。分别对Hes1、BrdU、Doublecortin（DCX）、NeuN采用免疫荧光技术染色并进行相应的细胞计数，初步分析BrdU、Hes1双阳性细胞的细胞类型及表达水平。在显微镜下分离海马齿状回，采用Western blot检测Hes1的蛋白水平，观察对比两组间Hes1蛋白表达的差异。结果：（1）Western blot检测中A组中的Hes1蛋白的表达水平明显高于N组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。（2）Hes1（+）细胞主要分布于齿状回颗粒细胞下层，并且大部分Hes1阳性细胞同时表达Brdu；（3）A组Hes1（+）细胞数量明显多于N组，而BrdU（+）细胞明显少于N组，且差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：Hes1在幼年小鼠与成年小鼠齿状回颗粒细胞下层中的表达差异，导致了神经细胞增殖水平的不同，表明Hes1的高表达可能抑制了神经再生。

Hes1； 齿状回； 神经再生

成年大脑仍然存在着神经再生，这一观点目前已得到了广泛的认可。之前的研究表明神经元生成的两个主要部位分别为海马齿状回的颗粒细胞下层（SGZ）与侧脑室室管膜下区（SVZ）[1]。神经再生是一个主动调节的连续过程，包括多能干细胞的增值、分化、迁移和成熟[2-3]。在发育过程中，表达于海马齿状回中的神经前体细胞中的碱性螺旋-环-螺旋基因（basic Helix-Loop-Helix genes， bHLH genes），在成年神经再生中起着至关重要的作用[4-5]。Hes1作为bHLH基因的转录因子之一，其表达可能会抑制多能干细胞的增殖和神经再生[6]。本文以神经再生活跃的新生小鼠（10 d）作为对照，检测成年小鼠中Hes1的表达，进一步阐明Hes1的表达与成年神经再生的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取16只C57BL/6雄性小鼠，分为以下两组：（10 d，N组）幼年组和（4个月，A组）成年组，每组8只小鼠，并且成年组小鼠在动物室饲养10 d以适应环境。

1.2 BrdU给药方法与标本制备 两组小鼠均以BrdU 50 mg/kg腹腔注射给药3 d，2次/d，每次间隔12 h，最后一次注射2 h后予戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，经升主动脉灌注生理盐水100 mL，4％多聚甲醛液（pH 7.4）500 mL后，断头取脑，将脑组织置入4％多聚甲醛固定过夜，20％蔗糖4 ℃沉底。选择海马部位应用冰冻切片机冠状位连续切片，脑片厚度为35 μm，每隔140 μm取一张脑片，将脑片放入防冻液中保存以备用。

1.3 免疫荧光染色 通过免疫荧光染色方法对Hes1、BrdU、Doublecortin（DCX）、NeuN染色并进行细胞计数。具体步骤如下：用0.01 mmol/L PBS漂洗组织切片5 min×3次，后加入2 mol/L HCL室温下变性1 h，用0.1 mmol/L柠檬酸钠中和10 min，80 ℃下抗原修复0.5 h，待其恢复到室温，继续PBS液漂洗组织切片5 min×3次，加入0.5％ Triton和马血清的混合封闭液中室温下摇床1 h。吸去原有封闭液，再次加入封闭液，依次按比例加入一抗，4 ℃反应48 h，PBS洗3次，5 min/次，转入0.5％ Triton中，避光条件下，分别按比例加入二抗，37 ℃反应1 h，PBS洗3次，5 min/次，避光铺片、甘油封片，最后在荧光显微镜下观察脑片。

1.4 细胞计数 所有小鼠随机选取6个非连续的脑片进行细胞计数，荧光显微镜下观察小鼠齿状回颗粒细胞下层BrdU与Hes1双阳性细胞数，以及Hes1与其他细胞标记蛋白的表达。

1.5 统计学处理 使用SPSS 17.0软件包行统计学分析，计量资料采用（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组海马齿状回组织中Hes1蛋白的表达情况比较 Western Blot检测结果显示，N组和A组中均有Hes1基因的表达，见图1。经过与β-actin内参相比较，A组中蛋白表达（0.40）明显高于N组（0.21），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 Western Blot检测海马齿状回组织中Hes1蛋白的表达情况

2.2 Hes1在小鼠海马齿状回的分布 通过对Hes1进行免疫荧光染色显示，Hes1主要表达在齿状回的颗粒细胞的下层。与N组相比，A组中Hes1阳性的细胞数明显增多。同时，通过对Hes1进行免疫荧光染色，其表达水平与BrdU一致，且局限于SGZ，图2A和D。免疫荧光染色表明，仅部分Hes1蛋白表达于DCX阳性细胞（未成熟神经元），但不表达于NeuN阳性细胞（成熟神经元）。

2.3 神经干细胞增殖情况 Hes1与BrdU的合并染色表明，只有部分BrdU阳性细胞与Hes1阳性细胞重合，但是几乎所有Hes1阳性细胞均为BrdU阳性，见图2 C和F。BrdU阳性细胞数量可以代表海马齿状回颗粒细胞下层神经再生水平。笔者的实验结果表明，幼年小鼠中BrdU阳性细胞数（3336±63）个明显高于成年小鼠（347±16）个，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

3 讨论

包括人类在内的成年哺乳动物整个生命过程中都存在着神经再生，这一事实目前已得到了广泛的认可。近些年的研究已经表明，Notch信号通路在神经干细胞的自我更新、增殖、分化中发挥着重要作用[7-8]。Notch-Hes信号传导通路中靶基因Hes1，是调节哺乳动物中枢神经系统发育的bHLH基因的转录因子之一，其可能对神经元的分化起着负调控的作用[6]。相关研究表明，神经元生成水平会随着年龄的增加而逐渐下降，C57/BL6小鼠DG增长在出生后的前7 d相对缓慢，7～14 d增长加快，而后增长速度又再次减缓，到3个月趋于稳定，所以，齿状回颗粒细胞下层的神经元生长在幼年小鼠中处于活跃期[9]。笔者通过免疫细胞化学染色方法发现，海马齿状回中成年小鼠BrdU阳性细胞数量明显少于幼年小鼠，表明幼年小鼠神经元生成的数量显著多于成年小鼠。Western Blot显示，与幼年小鼠相比，成年小鼠海马齿状回颗粒细胞下层的Hes1表达明显增加。相关体外实验表明，Hes1的表达抑制中枢神经系统中神经前体细胞的增殖和神经再生[10]。因此笔者推测，Hes1在幼年与成年小鼠齿状回颗粒细胞下层中的表达差异，导致了神经细胞增殖水平的不同，表明Hes1的高表达可能抑制了神经再生。另外，笔者还进行了Hes1与DCX、NeuN的双染色，发现Hes1的表达局限在海马齿状回的颗粒细胞下层，部分表达于DCX阳性细胞（未成熟神经元）但不表达与NeuN阳性细胞（成熟神经元），所以笔者猜测，Hes1可能只表达于增殖和分化状态下的神经前体细胞。研究表明，Hes1的震荡表达可以抑制Ngn2的表达[11]。笔者之前的研究表明，新生神经元数量明显减少可能是由于成年个体Ngn2的低表达导致的[12]。因此笔者推测，Hes1通过抑制Ngn2的表达而间接地抑制神经再生。

图2 幼年与成年小鼠海马齿状回Brdu/Hes1免疫荧光双重染色注：在海马齿状回中幼年小鼠BrdU（+）（绿色）细胞数明显多于成年小鼠（B、E）；同时，Hes1（红色）的表达在两组之间存在明显差异（A、D），且Hes1（+）细胞只局限于SGZ；但是，并非所有Brdu（+）细胞均表达Hes1（C、F）

但是，成年小鼠海马齿状回颗粒细胞下层中的Hes1是通过什么机制激活的，目前尚无相关研究。激活后的Hes1是如何抑制Ngn2表达的，目前尚无定论，通过下调Hes1的表达能否促进神经再生，这些都是有待笔者进一步研究的问题。

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The Relationship Between Hes1 Expression and Adult Neurogenesis of Dentate Gyrus in Mice/

GAO Feng，ZHANG Zhen，KANG Xiao-kui，et al./Medical Innovation of China，2015，12（10）：015-018

Objective：To investigate the effect of Hes1 on adult neurogensis from the level of neurogenesis and Hes1 expression in dentate gyrus of hippocampus between neonatal mice and adult mice.Method：The C57BL/6 male mice were separated into two groups：the newborn mice was as control for neonatal group（10 days old，N group），and the adult mice （4 months old， A group） were assigned to adult group，8 mice in each group.The immunofluorescence staining of Hes1，Brdu，Doublecortin （DCX） and NeuN were performed and the cell count was corresponding recorded，double positive cells types and level of expression were preliminary analyzed of Brdu，Hes1.The hippocampal dentate gyrus was separated in microscope，Hes1 protein levels were detected by Western blot， the differences of two groups’Hes1 protein expression levels were observed and compared.Result：（1）Hes1 protein levels of A group was hingher than the N group from Western blot detection，the difference was statistically significant（P＜0.05）；（2）Hes1 positive cells mainly distributed in the dentate gyrus granular cell lower， and most Hes1 positive cells expressed Brdu at the same time；（3）the group A of Hes1（+） cells significantly was more than N group， and BrdU（+） obviously less than N group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：The different expression of Hes1 from neonatal mice and adult mice in dentate gyrus of hippocampus，lead to different neurons generated levels， indicating high expression of Hes1 may inhibit neurogenesis.

Hes1； Dentate Gyrus； Neurogenesis

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.10.005

2014-12-24） （本文编辑：周亚杰）

国家自然科学基金（30973090）；山西省自然科学基金面上项目（2014011041-8）

①天津医科大学总医院、天津市神经病学研究所、天津市神经损伤变异与再生重点实验室 天津 300052

②山西省长治医学院附属和济医院

杨新宇

First-author’s address：Tianjin Medical University General Hospital；Tianjin Neurology Institute；Tianjin Key Laboratory of Injuries Variations and Regeneration of Nervous System，Tianjin 300052，China