左旋肉碱改善顺铂诱导肾损伤机制的相关研究

李 敏，那 宇，高建军

(1.安徽医科大学解放军306临床学院;2.中国人民解放军306医院肾内科，北京 100101)

左旋肉碱(即左卡尼汀，L-carnitine)，又称维生素BT，是一种广泛存在于机体组织内的特殊氨基酸，是动物能量代谢必需的体内天然物质，其在脂肪代谢中发挥重要作用，并具有抗炎、抗氧化及抗凋亡的作用。近年来多项研究显示左旋肉碱对顺铂诱导的肾损伤具有明显的保护作用，其主要机制综述如下。

1 左旋肉碱的药理作用

左旋肉碱可在体内由赖氨酸和蛋氨酸内合成而来，亦可通过肉类食物外转换获取，同时谷物、水果和蔬菜也可少量提供。充足的左旋肉碱对脂肪酸代谢和酰基辅酶A中间体的线粒体解毒作用是十分必要的。因催化脂肪酸氧化的酶均存在于线粒体基质中，活化的脂酰辅酶A(CoA)分子必须经肉毒碱穿梭系统将胞质中的脂酰CoA转运至线粒体内才能进行氧化分解。肉碱脂酰转移酶Ⅰ和Ⅱ是一组同工酶，前者存在于线粒体内膜外侧，催化脂酰CoA上的脂酰基转移给肉碱，生成脂酰肉碱;后者位于线粒体内膜内侧，将转入的脂酰肉碱上的脂酰基重新转移给线粒体基质中的CoA，游离的肉碱则被运回内膜外循环使用。左旋肉碱将形成脂肪酸所需的长链酰基从细胞质基质中转运至线粒体，使脂肪酸得以顺利转化为乙酰辅酶A实现β氧化生成能量，同时其可抑制长链脂肪酸异常升高对磷脂双分子层的破坏，稳定线粒体膜，从而通过这一机制发挥抗炎、抗氧化及抗凋亡的作用。但近年来研究发现其主要药理作用并不局限于此，尚需进一步研究。

2 顺铂诱导的肾损伤

顺铂是一种高效广谱的抗肿瘤药物，易出现胃肠道反应、骨髓抑制、耳毒性等不良反应，因其有在肾脏高聚集、高排泄和高代谢的特点，剂量依赖性肾损伤的表现尤为突出，常可限制顺铂在临床上的应用。顺铂引起的肾损伤范围广泛，包括急性肾损伤、远端肾小管酸中毒、肾浓缩功能障碍、一过性蛋白尿、高尿酸血症、类Fancon综合征、低镁血症、低钙血症、促红细胞生成素缺乏、血栓形成性微血管病和慢性肾功能衰竭等。顺铂同时也是一种强有力的氧化还原物质，能生成有毒的活性氧，从而导致各种细胞和组织的氧化损伤。由于肾脏的特殊结构，这种氧化作用对其损伤巨大。顺铂性肾损伤的基本过程包括以下几方面:药物在肾实质上皮细胞的累积，肾脏通过γ-谷氨酰转肽酶代谢活化使毒性增强，DNA链间链内交联和随后的DNA损伤的形成，线粒体DNA和呼吸功能受损，凋亡通路的激活和炎症反应的启动［1］。

3 左旋肉碱对顺铂诱导肾损伤的保护作用

3.1 抗氧化作用 线粒体含有自身独特的环状裸露DNA，极易发生突变和遭受攻击。作为细胞氧化功能中心，线粒体在能量代谢、自由基产生、衰老、细胞凋亡中起重要作用［2］。顺铂可直接损伤线粒体DNA，或产生大量自由基攻击及改变离子转运蛋白活性进而破坏细胞离子平衡，改变线粒体通透性，降低跨膜电位，从而影响肾小管上皮细胞线粒体功能，导致三磷酸腺苷(ATP)生成障碍。线粒体损伤可使氧化呼吸链功能受损，引起活性氧生成增加和聚集，自由基产生过多。顺铂肾毒性既与抑制肾皮质清除自由基的能力，导致自由基增多，脂质过氧化增强有关;也与通过降低多种自由基清除酶的活性，使自由基清除减少，加重氧化应激有关。王黎等［3］研究了脂质过氧化在顺铂诱导肾损伤中的作用，发现肾皮质丙二醛(MDA)含量升高，超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性降低，且肾皮质SOD、GPx活性与肌酐、尿素氮含量呈负相关，而MDA呈正相关。MDA为脂质过氧化产物，SOD、GPx是体内最重要的自由基清除剂。证明了顺铂引起的肾损伤与肾皮质脂质过氧化增强有关，且随剂量增加肾皮质损伤加重。

自由基生成的先决条件是线粒体电子传递系统释放自由电子，左旋肉碱可阻断该反应的进行。多个研究表明左旋肉碱可以对抗氧化应激，其通过清除过氧化氢和超氧自由基以及螯合过渡金属离子发挥抗氧化作用，同时左旋肉碱还可改善过氧化损伤中GPx，过氧化氢酶(CAT)和SOD的活性从而保护内源性抗氧化防御系统［4］。Chang等［5］根据左旋肉碱的抗氧化特性评估了其在顺铂诱导肾损伤中的预防性保护作用，结果显示左旋肉碱可明显抑制顺铂引起的肌酐及尿素氮的升高，改善近端小管细胞的损害，同时有效阻止MDA的升高。顺铂也可引起肾皮质完整线粒体DNA数量显著减少，而左旋肉碱能防止这些发生。在极谱分析法测试中，可观察到左旋肉碱治疗显著抑制了顺铂引起的线粒体呼吸控制指数的下降。由此推断氧化应激和脂质过氧化反应是参与顺铂诱导肾损伤的发病机制之一，而左旋肉碱可以抑制顺铂导致的线粒体功能障碍、DNA损害、脂质过氧化反应和肾脏上皮细胞凋亡。同时他们也研究了左旋肉碱对顺铂抗癌性的影响，发现左旋肉碱并没有减弱顺铂的抗肿瘤作用。

Cayir等［6］同样验证了氧化应激是顺铂肾毒性的一个机制。与对照组相比，顺铂组MDA生成增多，谷胱甘肽(GSH)、GPx、谷胱甘肽 s-转移酶(GST)和SOD的组织活性明显降低，而补充左旋肉碱后这些指标均有所恢复。左旋肉碱的天然短链衍生物，丙酰左旋肉碱，可完全逆转顺铂导致的组织GSH的降低和肾硫代巴比妥酸反应物(TBARS)及硝酸盐/亚硝酸盐(NOX)总量的升高，而后两种指标反映了脂质过氧化的程度［7］。

目前抗氧化应激被认为是左旋肉碱保护顺铂肾毒性最主要的作用机制，其通过清除自由基、减少脂质过氧化、增加线粒体ATP生成等改善顺铂引起的氧化改变和组织病理学损伤。

3.2 抗炎作用 大量研究提示，级联放大的炎症反应可能是顺铂诱导的急性肾功能损伤的重要原因之一［8］。顺铂产生的羟自由基参与p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化，介导肿瘤坏死因子α(TNF-α)的合成。TNF-α可激活促炎细胞因子和趋化因子，使白细胞聚集，诱发氧化应激，引起肾小管、肾小球和肾实质细胞损伤和坏死，表现为急性肾损伤。TNF-α诱导产生活性氧簇(ROS)，ROS激活转录因子核因子κB(NF-κB)，后者又诱使促炎细胞因子如TNF-α的产生，从而陷入恶性循环，加剧肾脏损害［9］。

左旋肉碱可有效降低血清中的炎症因子，从而改善心、肺、肾等重要脏器衰竭时的炎症状态，如慢性充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺病及维持性血液透析的微炎症状态等。通过抑制外周血单核细胞内磷酸化蛋白水平和c-Jun氨基末端激酶(JNK)活性，抑制外周血单核细胞的活性和促炎症因子的产生［10］。在左旋肉碱改善顺铂耳毒性的研究中发现左旋肉碱可显著改善顺铂引起的耳蜗毛细胞中多种促炎细胞因子的升高［11］。但关于左旋肉碱通过调节炎症因子改善顺铂肾毒性的相关详细报道并不多见，还有待进一步研究。

3.3 抗凋亡作用 顺铂可引起肾小管上皮细胞凋亡，具有剂量及时间依赖性，不同浓度和作用时间引起细胞死亡的方式不同。低浓度顺铂(8 μmol·L-1)可引起细胞凋亡，出现典型的细胞皱缩，染色体浓缩及核碎裂。而高浓度的顺铂(800 μmol·L-1)直接引起肾小管上皮细胞坏死，出现胞浆肿胀，胞浆完整性消失。Caspase是一组半胱氨酸蛋白酶，凋亡的发生即通过Caspase实现的。在一定条件下，启动子Caspase自身催化激活后引起一系列下游Caspase的激活，从而引发凋亡的发生。细胞凋亡有三条主要通路，即线粒体介导的内源性途径、死亡受体介导的外源性途径及内质网应激途径。顺铂引起的凋亡过程涉及上述3种通路，最终都导致Caspase-3/7活性升高，出现凋亡的典型表现［12］。其中线粒体介导的内源性途径作用最重要，在此通路中细胞色素C从线粒体释放分别导致Caspase-8及Caspase-9的激活，进一步引起Caspase-3的活化，而 Caspase-3在凋亡过程中起核心作用［13］。

左旋肉碱具有抗凋亡作用，可抑制Fas分子诱导的凋亡，降低重组Caspase-3、8、9的活性。Tufekci等［14］证明了肉碱的抗凋亡作用可减弱顺铂引起的肾小管上皮细胞凋亡。在注射顺铂后给予乙酰左旋肉碱(ALCAR)可显著改善顺铂引起的Caspase-3、8、9活性的升高，减轻顺铂导致的肾组织损伤。证明了内源性线粒体途径在顺铂肾损伤中的作用及ALCAR在顺铂引起肾脏细胞凋亡中起保护作用。顺铂引起的氧化应激反应又可使脂肪酸游离体增加，游离的脂肪酸与线粒体内电压依赖性通道反应，引起细胞膜通透性的快速改变，并将细胞色素C从线粒体内释放出来，进一步导致细胞凋亡。

Fas分子是死亡受体的代表，与配体结合后可通过其胞内段的死亡域和胞质中衔接蛋白FADD(Fas相关死亡域蛋白)间的相互作用增强Caspase-8酶原的弱蛋白水解活性，启动Caspase级链反应，激活下游的效应Caspase，通过死亡受体介导的凋亡途径诱导细胞凋亡。线粒体途径中细胞色素C使Caspase-9酶原间相互靠近自我剪切而活化［15］，活性 Caspase-9作为蛋白酶激活 Caspase-3、7。而Caspase-9也参与了内质网应激凋亡途径中Caspase-12途径［16］。最终均通过激活凋亡效益蛋白Caspase-3启动凋亡的发生。因而左旋肉碱在顺铂肾毒性中的抗凋亡作用可能是通过线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径共同完成的。

3.4 改善肉碱缺乏 左旋肉碱主要在肾脏代谢，经肾小球滤过后，85%以上经肾小管重吸收进入血液循环，其余主要以酰化左旋肉碱形式从尿液排出。顺铂可引起肾小管上皮细胞急性坏死、变性，间质水肿，肾小管扩张、重吸收功能降低及肾小球滤过率减少，从而引起肉碱生成及重吸收减少，造成体内肉碱缺乏。肉碱/有机阳离子转运蛋白2(OCTN2)是肉碱分子膜通透性的决定因素，对肉碱的转运具有重要意义［17］，而顺铂可通过下调 OCTN2的表达影响尿液肉碱水平［18］。

肉碱缺乏是否是顺铂肾毒性的一个危险因素，补充左旋肉碱能否通过提高肉碱浓度从而减轻顺铂导致的肾损伤?Sayed-Ahmed等［19］通过实验给出了答案。肉碱有左旋和右旋两种构象，体内具有生物活性的是左旋肉碱，右旋肉碱不仅没有生物活性还会与左旋肉碱产生竞争关系，造成肉碱缺乏。通过腹腔注射右旋肉碱可制备左旋肉碱缺乏大鼠模型。实验结果显示顺铂组肾组织总肉碱量显著减少，右旋肉碱组肾肉碱缺乏是由于左旋肉碱的耗尽，与只予右旋肉碱或顺铂组相比，右旋肉碱和顺铂联合用药导致肾肉碱水平降低更明显，而顺铂注射前/后给予左旋肉碱可使肾肉碱总量基本恢复正常。不过这几组治疗都没有引起血浆肉碱水平发生显著变化。顺铂治疗组肾组织ATP水平降低，左旋肉碱可改善ATP的消耗而右旋肉碱不能。与单独予顺铂治疗组相比，顺铂+右旋肉碱组显示肾组织损伤更加严重，而左旋肉碱+顺铂组的大鼠肾组织退行性变化最少。左旋肉碱可改善顺铂引起的肾功能衰竭，而右旋肉碱则相反。总之，该实验的数据说明肾肉碱缺乏可能是参与顺铂致肾毒性的一种风险因素或机制，补充左旋肉碱可减轻顺铂所致的肾功能损伤。

3.5 调节基质重塑 顺铂导致的肾毒性对肾脏既有急性作用也有慢性影响:急性变化是由于顺铂对肾小管上皮细胞的细胞毒性作用，而慢性改变可导致肾小管间质纤维化。肾间质纤维化是顺铂的一个主要并发症，这是由于肾细胞外基质蛋白的不断聚集，而基质重塑对正常组织的生成十分重要。基质金属蛋白酶(MMP)在细胞外基质(EMC)重塑中发挥重要作用，特别是MMP-9参与了肾脏ECM的正常降解［20］。肾小管上皮细胞和基底膜的相互变化在肾小管萎缩起关键作用，MMP-9生成增多对结构的改变有决定性作用。生理状态下，ECM的合成及降解是由蛋白水解基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑制剂(TIMPs)的相互作用来平衡的。

Martinez等［21］研究了 MMP-9与 TIMP-3在左旋肉碱保护顺铂性肾损伤中的变化，发现顺铂治疗15 d的大鼠肾小球和肾小管区域的MMP-9表达明显增强，TIMP-3的活性显著降低，表明基底膜退化，ECM成分改变及肾小球功能降低，最终导致肾小球膜增厚。左旋肉碱治疗15 d的大鼠MMP-9活性普遍减弱，TIMP-3在肾脏表达能力的恢复可能与肾小球系膜ECM中MMP-9的表达减少有关。表明MMP-9和TIMP-3参与的基质重塑在顺铂治疗后发生肾小球硬化和间质纤维化中扮演重要角色，左旋肉碱能通过调节MMP-9和TIMP-3间的关系改善顺铂对肾脏的损伤。

总之，左旋肉碱可改善顺铂诱导的肾损伤，减轻肾功能损害程度，防止或减少顺铂引起的肾组织病理性改变。在药物性肾损伤的临床治疗上具有广阔的前景。但需注意的是也有报道称左旋肉碱在顺铂导致的肾损伤中没有保护作用，考虑可能与用药剂量同其他实验的用量不同有关［22］。而有意思的是Yürekli等［23］的实验设计与其大致相同，却证明了左旋肉碱在顺铂肾毒性的保护作用及定量肾Tc 99m DMSA吸收对检测顺铂肾毒性及左旋肉碱保护作用的应用价值。关于左旋肉碱改善顺铂诱导的肾损伤的作用机制尚未完全明确，还有待于进一步的研究和探讨。

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