Wilson病非铜蓝蛋白结合铜研究进展



·综述讲座·

Wilson病非铜蓝蛋白结合铜研究进展

汪世靖程楠韩咏竹

[关键词]Wilosn病；非铜蓝蛋白结合铜；作用机制；研究进展

Wilson’s病(Wilson disease,WD)是一种遗传因素导致的铜代谢障碍疾病，以肝脏和脑损伤为主要临床表现[1]；WD最早在1912年由Samuel Kinnier Wilson首次详细报道[2]，当时被认为是一种罕见的家族性疾病以进展性的豆状核变性和肝硬化为主要特征，但对其发病原因尚不清楚。1928年Hall首先提出基因致病的可能，1993年WD的致病基因ATP7B基因被定位在13号常染色体[3, 4]，由于该基因编码的ATP7B蛋白的减少，导致WD患者体内铜的排出障碍而在体内蓄积，最终引起肝脏损伤和以锥体外系为主的临床症状。因此，驱铜治疗自Walshe[5]首次使用青霉胺开始就一直作为WD的主要治疗手段。而体内大多数铜是与铜蓝蛋白稳定结合，不能被驱铜药物络合而排出体外，对WD的病理损伤相对较小；而非铜蓝蛋白结合铜则对WD的发病、治疗具有重要意义。现将国内外相关研究报道综述如下。

1非铜蓝蛋白结合铜

铜蓝蛋白是一种α-1-酸性糖蛋白，90%的WD患者铜蓝蛋白水平低于正常人；一般来说，铜作为体内重要的微量元素，主要以两种形式存在，结合铜和离子铜，结合铜又包括与铜蓝蛋白稳定和非铜蓝蛋白结合的铜；结合铜和游离铜之间可以迅速交换。这种氧化还原属性必须在其酶活性铜的作用下完成。然而，未结合或游离铜可以快速生成活性氧和对细胞产生有害影响[6]。Walshe等[7]研究发现正常人血清中游离铜总量约占10%，而WD患者由于体内铜蓝蛋白含量的下降则导致了游离铜总量的升高。但随后其发现游离铜的概念不能精确的说明这种非结合状态下的铜，因此提出非铜蓝蛋白结合铜的概念。为说明血清游离铜和WD患者之间的关系，Walshe[8]对320位WD患者的血清游离铜和尿铜之间的进行了相关性分析，结果显示，WD患者血清游离铜和尿铜之间的比率从治疗前的7 ∶1下降致治疗后的5 ∶1，且结果相对分散并无直接的线性关系。因此，Walshe提出将游离铜的说法更改为更复杂的非铜蓝蛋白结合铜的概念，并且说明了非铜蓝蛋白结合铜中大多数是与白蛋白结合，在肾脏出现损伤时，这部分铜可通过肾脏排出体外。

2非铜蓝蛋白结合铜的分离和检测方法

由于WD患者非铜蓝蛋白结合铜含量较低，如何精确的分离和检测非铜蓝蛋白结合铜，尚无统一的标准。Bohrer等[9]比较了超滤法和固相萃取法分离血清游离铜和蛋白结合铜在WD诊断中的应用，应用石墨炉法对两组样品进行检测，结果表明固相萃取法相比与超滤法具有需要的血清标本量少、分离时间短、精确度和准确度更高的优点。张源等[10]应用石墨炉法测定乙醇-EDTA法分离的血清中不同形态的铜和锌，其中铜检测限为1.2 μg/L，回收率为92.3%～104.0%；正常人血清样品非铜蓝蛋白结合铜约占总铜含量的8%，WD患者的血清非铜蓝蛋白结合铜约占总铜含量的20%；因此提出该方法可作为检测血清中蛋白质紧密结合和疏松结合的铜含量。

作者单位： 230038合肥安徽中医药大学(汪世靖)

230061合肥安徽中医药大学神经病学研究所附属医院(汪世靖，程楠，韩咏竹)

虽然上述两种方法均可很好的分离WD患者血清中非铜蓝蛋白结合铜和铜蓝蛋白结合铜，但所应用的均为未进行驱铜治疗前的WD患者血清标本，而很多WD患者在经驱铜治疗后体内总铜含量均会降至较低水平，此时上述石墨炉法检测血清非铜蓝蛋白结合铜的检测精密度如何尚不可知。因此，仍需探讨检测精密度更高的检测法对驱铜治疗后WD患者血清非铜蓝蛋白结合铜的检测限。

3非铜蓝蛋白结合铜在WD发病机制中的作用

由于非铜蓝蛋白结合铜约占体内铜总量的10%，且这部分铜是处于不稳定结合状态，能够被铜络合剂络合而排出体外。因此，非铜蓝蛋白结合铜在WD发病机制中是否占据一定地位成为研究探讨的热点。

铜在WD发病的过程中占据重要地位，WD主要的发病机制是由于遗传因素导致的铜代谢障碍，使得铜在体内大量蓄积而对机体产生损伤。关于WD病因学的研究认为[11]，基因遗传因素是导致WD患者体内铜过量蓄积的主要因素。Purchase[12]认为WD患者体内铜过量的原因是胆道排铜功能损伤引起的，铜作为重要的微量元素参与了红细胞生成、合成线粒体氧化呼吸作用重要酶的辅助因子以及神经递质的合成等等，不仅铜缺乏将导致生理活动中很多重要的酶缺乏，而且过量的铜则会对细胞产生损害。近年来相关研究[13]表明神经细胞通过包膜上的铜转运体Ctr1蛋白将铜转运进入胞内，其中绝大部分与还原性谷胱甘肽、金属巯蛋白等结合；而在胞内的铜则由Cox17蛋白转运至线粒体，参与细胞色素C氧化酶的合成；过量的铜则与Atox1蛋白结合被转运至高尔基体与ATP7B蛋白结合排出细胞。但WD患者由于ATP7B蛋白的缺乏，致使过量的铜在细胞内大量蓄积，引起铜相关蛋白的功能异常，线粒体酶Cytox功能受损，诱发凋亡信号的释放，触发Caspase级联反应，引起细胞凋亡[14]。现有的研究结果表明高铜诱导的神经元发生氧化应激-凋亡级联反应有关的信号转导通路主要有：铜导致细胞内ROS的升高，线粒体功能失调，激活c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinaes,JNK)[15]和Caspase-3信号传导通路[16]；蛋白激酶p38通路的激活和细胞外调节蛋白激酶通路的抑制，非JNK通路的激活[17]；Brewer[18]发现铜诱导激活的酸性鞘磷脂水解酶分泌和神经酰胺释放；后者可以激活p38/SAPK、JNK等细胞信号通路；促进线粒体释放细胞色素C，与凋亡蛋白酶活化因子-1结合，导致Capase-9活化而激活caspase-3、6、7，引起神经元凋亡[19]。而铜与铜蓝蛋白结合较为紧密，不易分离，因此，有研究提出，非铜蓝蛋白结合铜可能与WD的发病存在一定的联系[20]，且WD患者体内非铜蓝蛋白结合铜的含量较正常人水平高，而非铜蓝蛋白结合铜与白蛋白、金属巯蛋白等结合较为疏松，容易发生解离通过线粒体氧化应激作用产生细胞损伤，但目前尚无实验依据证明。因此，非铜蓝蛋白结合铜是否通过上述途径对神经元产生损伤需进一步实验证明。

4非铜蓝蛋白结合铜与WD驱铜治疗后神经系统症状加重

周香雪等[21]使用青霉胺治疗的40例WD患者，15例(46.9%)患者出现神经症状加重，且症状加重的患者脑脊液铜含量较治疗前升高，血清铜较治疗前降低，而尿铜排出量则显著低于治疗前。因此，青霉胺治疗引起WD患者神经症状加重的原因可能是脑铜的增加引起的神经系统损伤有关；WD患者铜蓝蛋白水平较正常人低，患者脑铜总量增加时非铜蓝蛋白增加则更为明显；因而新近出现的神经系统损伤则可能是由非铜蓝蛋白结合铜通过氧化应激损伤产生。Chen等[22]对WD病模型TX小鼠采用青霉胺灌胃的方式，发现TX小鼠血清、脑游离铜在青霉胺治疗后的第3天开始升高，到第14天降低至治疗前水平，血清和脑中蛋白结合铜呈逐渐下降；氧化物前体丙二醛虽然在青霉胺治疗后第3天开始升高，但与正常对照组并无区别，而还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比率在治疗后的第3天开始下降，而正常对照组小鼠未出现任何变化。该项研究表明脑中游离铜的升高可能来源于脑实质而不是血清，且氧化力的升高很可能与新近神经元损伤有直接关系。

现阶段对WD驱铜治疗过程中出现神经系统症状加重的机制的假设主要包括驱铜治疗引起的原先组织中沉积的铜重新分布，新近产生的神经元损伤，继而引起相应的临床症状等；周香雪等[23]认为血清游离铜的升高可能并不直接与神经症状加重相关，但快速控制血清游离铜的变化，是WD治疗中阻止神经症状恶化的关键。如果在驱铜治疗期间有可以提供患者是否出现症状加重的血清学非铜蓝蛋白结合铜指标，这将有利于临床医师直观的判断患者是否会出现神经系统症状加重，而尽早的采取干预措施，使得患者可以获得更好的临床疗效。因此，探索在应用铜络合剂治疗的WD患者在最初的治疗时间段内出现神经系统症状加重与血清非铜蓝蛋白结合铜含量的相关性，将对于临床治疗具有很好的指导意义。

5展望

目前，血清非铜蓝蛋白结合铜在临床中尚未能成为常规检测指标，原因包括检测仪器的精密性以及检测费用的昂贵等等而常规使用的原子火焰吸收法由于检测灵敏度较差，无法精确的检测出非铜蓝蛋白结合铜的含量。且血清非铜蓝蛋白结合铜对WD患者驱铜治疗的预后评价具有一定的指导意义，而与患者驱铜治疗期间的临床表现变化的相关性尚未明确。因此，血清非铜蓝蛋白结合铜对WD治疗的临床意义尚需要临床大样本试验证明，同时尚需进行动物实验探索血清非铜蓝蛋白结合铜参与神经元损伤相关作用途径及作用机制。对此，有关血清非铜蓝蛋白结合铜的研究仍将致力于对选择更合适、合理、方便的检测方法的探索以及作用途径和作用机制验证；并通过明确其对临床治疗的指导价值，来丰富临床医师的判断标准。

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(2015-05-07收稿2015-08-01 修回)

通信作者：韩咏竹，hyz89722@sina.com

基金项目：国家自然科学基金项目(项目编号：81473535)

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.11.033