黄鳝受精卵致病菌的分离鉴定与药敏试验

黄鳝受精卵致病菌的分离鉴定与药敏试验*

通讯作者：周秋白(1965—)，教授，博士生导师，主要从事水产动物营养与繁殖研究。

宋明张锦华刘金海周秋白

(江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045)

摘要：苗种供应一直是黄鳝规模化养殖的制约因素，为提高黄鳝苗种培育成活率，本试验对黄鳝卵孵化过程中出现死卵和健康黄鳝卵及池水进行病原的分离鉴定和药敏试验。以死亡的黄鳝卵与健康黄鳝卵及池水所含细菌为研究对象，对疑似病原菌进行细菌分离培养、染色镜检、溶血和攻毒试验，然后进行生化鉴定，采用药物敏感试验测定病原菌分离株对多种抗生素的敏感性。结果表明：分离的5株菌为革兰氏阴性短杆菌，在血平板上均有明显β溶血环，其中有2株菌溶血环特别明显；通过腹腔注射小白鼠和浸泡黄鳝的动物实验发现致病能力非常强，经生化鉴定表明5株菌均为嗜水气单胞菌。药敏试验显示5株菌均对庆大霉素表现高度敏感，对恩诺沙星和诺氟沙星等敏感，对阿莫西林不敏感。

关键词：黄鳝受精卵; 嗜水气单胞菌; 分离鉴定; 药敏试验

收稿日期：2015-6-5

作者简介：宋明(1991—)，男，湖北随州人，硕士研究生，研究方向：水产动物疾病与防治。E-mail：songmingwell@163.com。

中图分类号：S941、42

文章编号：1006-3188(2015)02-0037-06

黄鳝亦称鳝鱼，属鱼纲，合鳃目，合鳃科，黄鳝属。营养丰富、肉质鲜美，深受消费者喜爱，是我国重要的特种淡水经济鱼类。随着国内外市场对黄鳝需求量的上升，捕捞强度加剧，加上环境的污染，黄鳝的野生资源量不断下降,其产量已不能满足市场的需求。为满足日益增长的市场需求，人工繁养殖已是趋势。因黄鳝具性逆转、怀卵量低及吐泡沫营巢孵卵等特点，致使其人工繁殖较其他鱼类困难。黄鳝出血病是生产过程中危害范围最广、造成损失最大的疾病。研究表明[1-2]嗜水气单胞菌是引起黄鳝出血病的主要病原菌，由该致病菌引起的患病黄鳝主要病症有出血病、肠炎。少数出血病为病毒引起。在近年来黄鳝人工繁殖过程中，发现有卵或苗成批死亡的现象，本试验主要针对黄鳝孵化过程中死亡胚胎进行致病菌的分离鉴定与药敏试验，确定该致病菌并为防治该菌引起的疾病提供理论指导。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品采集

选取黄鳝繁殖孵化试验中死亡和健康的受精卵及孵化水，进行细菌的分离。

1.1.2培养基和试剂

脱纤维兔血培养基(1%蛋白胨、0.5%牛肉膏、0.5%Nacl、2%琼脂粉、5%的新鲜兔血)，普通琼脂培养基，普通营养肉汤培养基，均按照常规标准[3]配置而成。药敏试纸和微量生化鉴定管购自杭州天和生物试剂公司。

1.2试验方法

1.2.1病原菌的分离与纯化

在无菌操作台，卵表面消毒后，用无菌镊子撕破卵膜，将胚胎液涂布于普通琼脂平板上，同时将有死亡黄鳝的池水和健康黄鳝池水各1ml分别涂于琼脂平板上。在30℃恒温培养箱内培养18～24h后观察，然后挑取疑似菌落在普通培养基上多次纯化，得到7株大小、形态相似的菌落。分别命名为D-1、D-2、D-3、D-4、D-5(均来源于死亡胚)、H-1(来源于健康的胚)、7-1(来源于池水，死亡与健康胚的池水中均有，但死亡胚的池水中此类菌落数量明显多于健康胚所在的池水)，挑取典型的菌落进行革兰氏染色，镜检，观察形态并记录结果。

1.2.2溶血试验

分别把七种菌划线或点种接种在已经配置好的脱纤维兔血培养基(5%兔血)平板上，在30℃恒温培养箱中培养18～24h，然后观察接种的菌落周围有无溶血现象及溶血圈的大小。

1.2.3小白鼠感染试验

将小白鼠分为五组(5只∕组)，另将具有溶血特性的四株菌D-3，D-5，H-1，7-1培养成菌液(浓度为1.5×108cfu/ml)，每只小白鼠注射0.2ml；对照组注射0.2ml生理盐水，观察[4]。

1.2.4黄鳝浸泡试验

依据1.2.3试验结果，挑选了2株对小白鼠致病力强的菌做浸泡健康黄鳝的实验。把D-3、7-1分为两组对黄鳝进行浸泡感染试验，在普通的桶中装50cm深的水，每个桶放有30条100g/条的黄鳝，并加入20ml的菌液(浓度同上)，在22℃左右的温室中培养观察[2]。

1.2.5细菌鉴定

用已经纯化好的5株菌D-3,D-4,D-5,H-1,7-1分别接种至到各种微量生化发酵管中，置恒温培养箱中培养18～24h，观察颜色变化并记录结果。

1.2.6药敏试验

将5株菌(同上)的肉汤培养物用无菌棉签蘸取菌液(浓度同上)均匀的涂在普通琼脂培养基平板上，待菌液吸收后，用无菌镊子轻按药敏片，确保贴稳。药敏片与培养基完全接触。放入生化培养箱中30℃培养18～24h。参照药敏纸片法的抑菌圈直径和敏感标准进行分析[5]。

2　致病菌的鉴定结果

2.1病原菌的鉴定

2.1.1细菌形态

观察普通培养皿上分离纯化的菌落形态，菌落圆形，边缘整齐、光滑，有乳白色和淡黄色2种。进行革兰氏染色，镜检，发现均为革兰氏阴性短杆菌 ，多为单个分散排列或2个连成短链(图1-a)。

图 1　部分病原菌形态及β溶血

2.1.2溶血试验

在5%兔血平板上培养的七株菌有五株出现溶血现象，分别为D-3、D-4、D-5、H-1、7-1，菌落周围呈透明状溶血环，其中H-1和D-3的溶血现象最明显较其它3株大(如图1-b所示)，而D-1、D-2则没有出现明显溶血现象。

2.1.3细菌鉴定结果

将纯化的细菌在无菌条件(无菌操作台)下接种到微量生化管中，在30℃恒温培养箱中培养24h后，生化鉴定结果符合《鱼类及其他水生动物细菌实用鉴定指南》[6]中对嗜水气单胞菌的描述(见表-1)，可初步鉴定为嗜水气单胞菌。从表格可以看出这五种菌的这些生化反应指标是一致的，从实验过程来看各菌间的颜色有些差异。

表 1　菌株的生化特性

注:“+”表示阳性，“-”表示阴性

2.2动物致病试验

2.2.1小白鼠感染试验结果

从菌落形态观察和革兰氏染色，以及溶血试验结果来看，D-4和D-5非常的相似，所以本试验设置了五组，D-3、D-5、H-1、7-1和空白对照组，对每只小白鼠进行腹腔注射0.2ml菌液(浓度为1.5×108cfu/ml)，经过10h观察，试验组全部死亡，对照组都无异常。解剖各实验组的死亡小白鼠发现7-1小白鼠的肝脏较其它组的出现明显的病理变化，肝脏变为灰褐色，体内液体多，内脏肿大，出血症状。进行肝脏分离培养发现与7-1吻合，证明这些菌对动物的有较强的致病力。

2.2.2黄鳝浸染试验结果

经过3d培养后发现D-3组的黄鳝表皮出现多处溃烂，是出血病典型的症状，取肝脏进行细菌分离培养得到了致病菌，7-1组黄鳝没有异常的变化，结果表明7-1对黄鳝的致病力比D-3弱很多。

2.3药敏试验

药敏试验的药片有九种(见表 2)。静置培养24h后,观察抑菌圈大小，并测量直径，结果见表2。发现各菌株对不同抗生素药物的敏感性存在一定的差异性。4株菌对庆大霉素高度敏感，5株菌对多种抗生素均呈现中度敏感，对杆菌肽、甲氧嘧啶、阿莫西林不敏感。

表 2　菌株对抗生素的敏感试验结果

注:“+++”表示高度敏感(20mm≤d)；“++”表示中度敏感(15mm≤d≤19mm)“+”表示低度敏感(10mm≤d≤14mm)； “-”表示不敏感(d≤9mm)。

3　讨论

本试验对黄鳝苗种的致病菌进行了分离鉴定与药敏试验，经过一系列的生化鉴定试验确定了引起苗种死亡的主要是嗜水气单胞菌。目前对嗜水气单胞菌的研究较多，如甲鱼穿孔病，草鱼肠炎、出血病，黄鳝的肠炎、出血症，异育银鲫的败血症等均进行过研究，但黄鳝卵和刚出膜的苗感染嗜水气单胞菌没有报道，可能是因为人工黄鳝繁殖没有广泛开展，更多的是在研究如何人工孵化的水质调控等技术方面的问题。嗜水气单胞菌在自然界中广泛分布，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中，有致病性菌株和非致病性菌株两种。致病性菌株可感染鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类等。实际病例中以急性出血性败血症为主要特征；慢性感染则主要表现为皮肤溃疡或肠炎。嗜水气单胞菌可以产生毒性很强的外毒素，如：溶血素、组织毒素、坏死毒素、肠毒素和蛋白酶等，当环境突变，水质恶化，鱼体抵抗力下降时，最容易出现爆发性出血病而由嗜水气单胞菌感染的疾病一般病势较猛，多为恶性，死亡率很高，对水产养殖的危害相当大，造成的经济损失非常多。在黄鳝育苗生产中应引起重视。

嗜水气单胞菌是一类复杂，独特的水生细菌群体，这个细菌群体有一定的共性，就如生化鉴定，菌落观察几乎都是一样的，但菌株间也有一定的差异，本试验在死亡胚和健康胚及池水中均能分离到溶血的嗜水气单胞菌，且这些菌对小鼠和黄鳝的致病性有差别。在小白鼠试验当中7-1组表现出较强致病性，而在大黄鳝浸染试验中就不如D-3。而本实验H-1是分离自健康苗种，溶血现象也非常明显，腹腔注射小鼠后能引起小鼠死亡，但没有引起黄鳝苗种死亡。从此推测菌株的致病与宿主及环境有密切的关系；嗜水气单胞菌是一种条件致病菌[7]，其同样存在健康苗种的水体中而未引起致病是值得研究的问题。本试验结果初步表明，该菌在健康苗种水体中的数量少于发病菌种水体，推测可能健康苗种水体中可能存在其它有益微生物抑制了嗜水气单胞菌的增长，具体有待于进一步的研究。

所分离的5株菌对抗生素敏感性也存在一定的差异性，这可能与菌株所生活的环境因素有一定的关系。王英光等[8]在对黄鳝肠炎细菌的分离与药物筛选的研究中得到的嗜水气单胞菌菌株对诺氟沙星、庆大霉素、卡那霉素等高度敏感，对青霉素、乙酰螺旋毒素、新生霉素、安苄青霉素、磺胺甲基异噁唑不敏感。邓国成等[9]分离的嗜水气单胞菌对环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星等高度敏感，对庆大霉素等敏感，对阿莫西林、杆菌肽、羧苄青霉素等不敏感。本试验得出的结果与之研究结果相似，药敏试验结果表明该致病菌对庆大霉素高度敏感，对呋喃唑酮、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、头孢氨苄敏感，对杆肽菌、甲氧嘧啶(TMP)、阿莫西林不敏感。该菌感染的主体是黄鳝卵，与一些患病鱼类具体表现出的症状及致病菌的研究数据对比存在一些差异，而且由于地域用药的特点不同，嗜水气单胞菌对一些抗菌药物耐药性也有一些差异，我们在生产过程中要根据当地的细菌耐药性情况进行合理的选择和使用。

临床上预防细菌所引起的水生动物疾病通常依赖于抗菌药物，使得菌株耐药性日益增加，给治疗带来很大的困难，也影响水产品的质量。杨丽莉等[10]通过对枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的研究，发现其对嗜水气单胞菌有很好的抑菌效果。李卓佳等[11]应用芽孢杆菌调控虾池，发现芽孢杆菌可以抑制条件致病菌的繁殖，促进物质和能量循环，有利于水体净化。从本试验后续结果看，对于嗜水气单胞菌这类条件性致病菌所引起的黄鳝苗种疾病的预防，可能通过调节水体中微生态环境是有效的途径。

参考文献

[1] 陈怀青，陆承平.嗜水气单胞菌:黄鳝出血性败血症的病原[J].中国人兽共患病杂志，1991，7(4)：21-23.

[2] 彭彬，杨光友，陈晓利，等. 黄鳝出血病病原菌的分离与鉴定[J].淡水渔业，2011，41 (3)：72-76.

[3] 姚火春.兽医微生物学实验指导[M].2版.北京：中国农业大学出版社，2002：19-22.

[4] 凌红丽，陆承平，陈怀青，马向东.6株嗜水气单胞菌的毒力因子及其对小鼠的致病性[J].中国兽医学报，1999，19(3)：255-257.

[5] 宋铁英，陈强，郑在予，等.不同来源嗜水气单胞菌的抗菌素耐药性及耐药机制分析[J].福建农业学报，2007，23(2)：119-124.

[6] 布勒.鱼类及其他水生动物细菌实用鉴定指南[M].北京：海洋出版社，2013：43-45.

[7] AUSTIN B,AUSTIND A.Bacterial Fish Pathogens:Disease in Farmed and Wild Fish[M].New York:John Wiley and Sons, 1987:364.

[8] 王英光，周海龙，王长兴. 黄鳝肠炎细菌分离及药物筛选[J]. 河北渔业，2013(5)：34-36.

[9] 邓国成，江小燕，叶星，等.草鱼出血病混合感染的嗜水气单胞菌的分离、鉴定与理化特性[J].微生物学通报，2009，36(8)：1170-1177.

[10] 杨丽莉，吕凤霞，别小妹，等.枯草芽孢杆菌抗菌脂肽对嗜水气单胞菌抑菌效果[J].食品科学，2011，32(1)：193-198.

[11] 李卓佳，郭志勋，冯娟，等.应用芽孢杆菌调控虾池微生态的初步研究[J].海洋科学，2006，30(11)：28-31.