HPVE6／E7mRNA与宫颈病变关系的研究进展

王丽梅 徐 琳

1（云南省第一人民医院 妇科，昆明650032）

2（昆明医科大学 第一附属医院妇科，昆明650032）

宫颈癌是全球女性第二大常见的恶性肿瘤，全世界每年约有50万宫颈癌新发病例，每年约有23万女性死于宫颈癌。其中80%的病例发生在发展中国家［1］。我国每年约有8万人死于宫颈癌，其死亡率为我国妇女恶性肿瘤第一位［2］。

经过大量流行病学和病毒学研究证实，高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染是宫颈癌发生和发展的首要因素。所以有效、积极地开展宫颈癌筛查，早期发现并及时干预，能够显著降低宫颈癌的发病率。由于E6和E7是HPV的癌基因，其表达必须通过E6／E7mRNA。因此2006年欧洲生殖器感染和肿瘤研究组织（European Research Organiza-tionon Genital Infection and Neoplasia，EUROGIN）取得了共识，认为HPV E6／E7mRNA检测应作为宫颈癌筛查的重点研究内容［3］。本文就HPV E6／E7mRNA与宫颈病变关系的研究进展做一综述。

1 HPVE6、E7mRNA检测技术的发展

到目前为止，美国FDA相继批准了4个宫颈癌高危HPV检测，依次分别为基于杂交捕获技术的Hybrid Capture 2，基于酶切信号放大技术的 Cervista HPV，基于实时荧光PCR技术的Cobas HPV，和基于转录介导等温扩增技术的Aptima HPV。前三种HPV检测是检测HPV DNA，属于第一代的高危HPV病毒检测方法。80% 以上的妇女一生中都会有HPV病毒感染，只有不到10%左右的HPV感染会发展为持续性感染。这些持续感染HPV的妇女则成为宫颈癌的高危人群。第一代的HPV DNA检测，虽然有较高的临床敏感性，但是，其特异性较低，这主要是因为 HPV DNA是结构基因，一旦发生感染，就能被检测到。而这些假阳性结果，会给患者带来不必要的心理压力，以及由此带来后续不必要的创伤性检查。

研究表明，HPV早期编码区E6、E7基因是病毒的两个关键致癌基因［4］。其通过转录mRNA实现癌蛋白的表达，从而改变细胞正常代谢，导致细胞发生病变直至癌变。在病毒感染的早期，病毒基因在细胞内为游离状态，此时E6、E7基因处于静默期，不表达或低表达mRNA，一过性HPV感染大多处于这个阶段。当HPV病毒发生持续感染后，病毒基因和人类基因发生整合，利用宿主细胞大量转录mRNA、从而导致大量癌蛋白的表达。所以癌基因E6、E7的表达是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌发生的必要步骤，其表达产物E6、E7蛋白是致癌的关键。所以检测高危型HPV病毒的E6、E7mRNA相比检测HPV DNA，可以更加精准的筛查病变，有效降低对一过性感染的检出率。

2 HPVE6、E7基因的致癌机理

HPV病毒属于乳头多瘤空泡病毒科病毒属，是一种小型、无外包膜的环状DNA病毒。包括3个部分：早期基因区（E）、晚期基因区（L）及长控制区（LCR）。其中，早期基因区可以编码 E1、E2、E6、E7等早期蛋白，E6、E7是主要的致癌基因；晚期基因区编码的后期蛋白质（L1和L2）病毒衣壳是结构性的组成部分，在病毒颗粒自我组装以及侵入目标细胞时起协调和识别作用。

而早期区（E区）编码蛋白基因中，由E6和E7基因编码的致癌蛋白是导致宫颈上皮癌变的重要因子，这两种蛋白通过抑制两种主要抑癌蛋白p53和视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）使被感染的细胞可无限增殖并恶性转变。E6蛋白通过E6相关蛋白（E6-AP）介导与抑癌蛋白p53结合，经过泛素途径使其降解，使细胞绕过细胞周期G1／S和G2／M检查点而转向恶性增殖。另外，E6通过阻断p53依赖的细胞凋亡途径阻止细胞凋亡，使基因异常的细胞得以持续增殖，最终导致细胞永生化和宫颈癌的发生［5］。E7蛋白可特异性结合视网膜母细胞瘤蛋白（pRb），pRb最重要的功能是与细胞转录因子E2F结合形成特异性pRb／E2F复合物，后者可以作为转录抑制因子，负向调控G1／S期的转变，抑制细胞周期的进展。E7蛋白特异性结合pRb后导致pRb／E2F复合物无法形成，从而促进G1／S期的转变和细胞分裂增殖加速［6］。

此外，E7蛋白也可使细胞周期相关负向调节因子p27和p16失活，使细胞生长停滞信号受到抑制，造成细胞周期紊乱，引起细胞无限增殖并向恶性转化。E6、E7联合作用可使有丝分裂纺锤体形成缺陷和中心体数目异常，导致染色体异常、基因不完整以及多倍体细胞的出现，促使细胞恶变和肿瘤的发生。有研究［7］表明：通过干扰RNA沉默E6、E7基因可抑制宫颈癌细胞的生长，并引起癌细胞凋亡；此外，HPV E6和E7癌基因在宫颈癌的浸润转移中起着重要作用，E6和E7与上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）密切相关。EMT是恶性肿瘤浸润转移的重要机制，通过下调黏附分子的表达使细胞间接触力降低同时细胞流动性增强，使恶性肿瘤细胞远处转移。E6和E7通过激活EMT转录因子Slug、Twist、ZEB1和ZEB2，使细胞发生EMT样改变，增强恶性细胞的侵袭力，使恶性细胞浸润转移［8］。同时，E6和E7还可影响宿主的免疫功能，抑制干扰素应答启动，导致病毒逃逸免疫系统的监视，促进肿瘤的进展［9］。

3 HPVE6／E7mRNA在低度宫颈病变中的应用

目前，HPV检测大多数针对病毒DNA，HPV DNA检测用于宫颈癌筛查的敏感度和特异性都高于细胞学检查。美国阴道镜和宫颈病理学会定期用HPV-DNA分型检测对30岁以上的妇女进行宫颈癌筛查。发现HPV-DNA分型检测过程中出现较高的假阴性现象，而且假阴性现象随着年龄增长而增加［10］。因此，HPV DNA检测对宫颈病变的风险预测过早。而癌基因E6和E7的表达是导致宫颈细胞恶性转化并发展至宫颈癌的必要步骤，相对于HPV DNA检测，E6／E7mRNA检测能够更精确地预测细胞向高度病变和癌症转变的可能性。研究证实HPV的基因表达只有一条途径（先转录，再翻译），转录产物E6／E7mRNA反映了基因表达的活性，因此，检测E6／E7mRNA是了解HPV表达情况的有效途径，其将是研究宫颈癌的主要方式。同时联合TCT可以有效地提高宫颈癌的准确率，排除假阴性患者［11］。Rossi等［12］提出阴道镜下活检结果为CIN1或正常的mRNA阳性妇女和mRNA阴性的妇女进展为CIN2＋的概率分别为每年18．4‰和3．6／‰。

王少蕾等［13］利用bDNA技术检测480例ASCUS以上（含ASCUS）的TCT标本进行了HPV E6／E7mRNA检测显示，细胞学严重程度的增加，E6／E7mRNA的表达同时增加，随着细胞病理学病变程度的增高，阳性率随之提高。27例癌的标本中，HPV E6／E7mRNA检测均为阳性，拷贝值较高。Tinelli等［14］的一项随访研究发现，mRNA阳性而活检正常的妇女进展为CIN的平均时间为12个月。因此，在细胞学和HPV DNA检测基础上再行E6／E7mRNA检测，根据E6／E7mRNA结果对妇女进行分层管理并制定个性化的筛查间隔时间可能更为合理，可降低宫颈病变的漏诊率，优于单独检测，可避免过度频繁的检查给患者带来的经济和心理负担。

4 HPV E6／E7mRNA在CINII及以上病变中的诊断价值

宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，HPV感染是宫颈癌发生的主要危险因素。几乎100%的高级别CIN以及宫颈癌都合并HPV感染［15］。目前，用于宫颈癌筛查的主要是细胞学联合HPV DNA检测，两者的检测结果不能给出病变的明确级别。研究证实细胞学和HPV DNA检测的特异度和阳性预测值低于HPV E6／E7mRNA检测［16］。Benevolo等［17］对489例细胞学异常和 HPV DNA阳性的妇女进行E6／E7mRNA检测和阴道镜活检，发现217例mRNA阳性的妇女中有121例活检结果为CIN2＋，272例mRNA阴性的妇女中仅53例活检结果为CIN2＋。研究证实：Aptima检测技术对诊断CIN2＋ （CIN2、CIN3和宫颈癌）的特异度和阳性预测值比第2代杂交捕获试验（HC2）和液基细胞学检测更高［18］。黄凌霄等［19］对426例患者研究发现 HPV E6／E7mRNA预测ASCUS患者CINII＋的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为 90．0%、64．2%、54．2%、93．2%。与HR-HPV DNA检测相比，其特异度和阳性预测值均较高，灵敏度、阴性预测值相近。

HPV DNA检测现广泛用于宫颈病变的筛查和随访，尤其是在ASCUS患者的分流中有重要作用。有研究发现，HPV E6／E7mRNA水平与组织学病变程度之间存在正相关性。因此在宫颈筛查过程中，HPV E6／E7mRNA水平越高，更需警惕宫颈病变甚至是宫颈癌的可能。因此，若将E6／E7mRNA作为宫颈癌的二线筛查方案，可更有效地筛查宫颈癌。

5 HPVE6／E7mRNA在CIN患者术后随访中的应用

宫颈锥切术是治疗CIN2＋的主要方法，但CIN病灶不完全清除仍会导致宫颈癌的发生，CIN经宫颈锥切术后残留及复发率很高，对于宫颈病变切缘阴性的患者，约25%患者出现残留或复发［20］。因此对于CIN患者的术后随访尤为重要。目前对于CIN治疗后的随访内容主要是细胞学和HPV DNA检测，但两者对于预测术后病灶复发的敏感度高而特异度低，导致临床医师的过度诊断和过度治疗。因此有学者提出将HPVmRNA检测用于CIN术后随访，但对于其预测术后复发的能力仍存在着争议。Frega等［21］认为其敏感度和阴性预测值高于HPV DNA检测，HPV mRNA用于预测宫颈病变复发的敏感度为 73．5%，阴性预测值为 97．0%，HPV DNA则分别为44．0% 和93．0%；但Zappacosta等［22］的研究证实：HPVE6／E7mRNA 预测CIN术后复发的特异度和阳性预测值高于细胞学联合HPV DNA检测，认为HPVmRNA能够更早且更为有效地预测术后病灶复发。李梅等［23］研究证实TCT、HPVE6／E7mRNA联合检测，可提高检测的敏感性，同时发挥E6／E7mRNA检测的特异性，避免过度诊断和治疗，减轻患者经济负担及心理负担。

6 结语

宫颈癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤之一，也是目前惟一可以预防的妇科恶性肿瘤，通过早期筛查及干预可以有效地阻止CIN向宫颈癌进展。HPV与宫颈癌的关系密切，HPV癌基因E6和E7在宫颈癌的发生和发展中发挥重要作用。目前已有多个国家开始进行宫颈HPV E6／E7mRNA大规模筛查，并积累大量临床资料。同时证实HPV E6／E7mRNA是宫颈细胞癌变的重要因素，HPV E6／E7mRNA检测不仅对ASCUS患者高级别病变具有较高的辨别能力，能更好地筛选出高危人群，其对判断宫颈HPV感染阶段、预测宫颈病变进展风险以及判断宫颈病变的严重程度具有重要价值。虽然，随着此类技术的不断更新，HPV E6／E7mRNA作为新的病毒分子对病毒癌基因活性的有比较直观反应，大大提高了HPV检测的敏感性、特异性、但其临床应用推广尚需大样本量的随机对照试验以及长期的随访。

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