三种柱前衍生化法测定乳粉中牛磺酸含量的方法比较

2015-12-16袁辉高帅王传兴

中国乳品工业 2015年3期

袁辉，高帅，王传兴

（新疆产品质量监督检验研究院，乌鲁木齐830011）

0 引言

牛磺酸是一种特殊的氨基酸，除了具有促进大脑及智力发育，保护视网膜的作用[1-4]，对肺、肝脏、胃肠等都有保护作用[5-6]。牛磺酸对婴幼儿大脑发育、神经传导、视觉机能的完善、钙的吸收有良好作用，是一种对婴儿生长发育重要的营养素[7]，国家标准中要求婴幼儿配方乳粉中牛磺酸的添加量约为3 mg/100kJ[8-9]。

目前，检测牛磺酸的方法主要为液相色谱的柱前衍生和柱后衍生两类，柱后衍生需要的装置较为昂贵，具有一定局限性。柱前衍生法有邻苯二甲醛（OPA）衍生法[10-12]、单磺酰氯衍生法[13-14]、2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生法[15-16]以及9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)衍生法[17]等。本研究选取了三种衍生试剂，利用柱前衍生法分别进行乳粉中牛磺酸的测定，同时进行方法比较，最终取得了满意的结果。

1 实验

1.1 主要仪器

waters 2695高效液相色谱仪，紫外检测器，离心机，恒温水浴锅，超声波仪。

1.2 试剂和材料

牛磺酸标准品sigma公司、单磺酰氯、9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)、邻苯二甲醛（OPA）、乙酸铵、甲醇、乙腈、乙硫醇为色谱纯，亚铁氰化钾、乙酸锌、无水碳酸钠、盐酸、盐酸甲胺、硼酸、氢氧化钠为分析纯。

配方乳粉，购于乌鲁木齐某超市。

2 方法

2.1 样品前处理

准确称取样品2.00 g，用40 mL温水溶解并超声10 min，加入蛋白沉淀剂各1 mL，用水定容至50 mL。试液于5000转/分钟下离心10 min，取上清液备用。

2.2 牛磺酸标准溶液的的配制

精确称取0.025 g牛磺酸标准品，用蒸馏水溶解后定容至25 mL，配成质量浓度为1 g/L的标准储备液，临用前配制成质量浓度为0，5，10，20，40，100 mg/L的标准工作液。

2.3 单磺酰氯柱前衍生化法

2.3.1 主要试剂的配制

浓度为80 mmol/L碳酸钠缓冲溶液：0.424 g无水碳酸钠，加入40 mL水溶解，用浓度为1 mol/L盐酸调pH值至9.5，用水定容50 mL。质量浓度为1.5 g/L单磺酰氯溶液：称取0.15 g用乙腈定容100 mL，临用前配制。质量浓度为20 g/L盐酸甲胺溶液：称取2 g用水定容100 mL，

2.3.2 衍生化方法

吸取2.1中的上清液1 mL到10 mL具塞玻璃管中，加入1 mL碳酸钠缓冲液，1 mL丹磺酰氯溶液，充分混合，室温避光衍生反应2 h（1 h后需摇晃1次），加入0.1 mL盐酸甲胺溶液涡旋混合，以终止反应，避光静置至沉淀完全。取上清液过滤，取滤液备用。同时取2.2中标准工作液1 mL与试液同步进行衍生。

2.3.3 色谱条件

色谱柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶浓度为0.02 mol/L乙酸铵缓冲溶液（pH=4）=60∶40（体积比），流速1 mL/min，柱温为30℃，检测波长（紫外检测器）为254 nm。

2.4 FMOC柱前衍生化法

2.4.1 主要试剂的配制

0.3 mol/L硼酸盐缓冲溶液：称取1.85 g硼酸，用浓度为6 mol/L氢氧化钠溶液调至pH值为8.0，用水定容至100 mL。质量浓度为1.5 g/L的FMOC溶液：称取0.015 g的FMOC溶于10 mL乙腈中。

2.4.2 衍生化方法

吸取2.1中的上清液100 μL,加400 μL FMOC 溶液及400 μL硼酸盐缓冲溶液，用乙腈定容至1 mL，超声震荡3 min，40度水浴反应10 min，上机测试。同时取2.2中标准工作液各100 μL与试液同步进行衍生。

2.4.3 色谱条件

色谱柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶浓度0.02 mol/L乙酸铵缓冲溶液（pH=4）=60∶40（体积比），流速1 mL/min，

柱温为30℃，检测波长为265 nm。

2.5 OPA柱前衍生化法

2.5.1 主要试剂的配制

浓度为0.4mol/L硼酸钠缓冲溶液配制：称取2.48 g硼酸和1.41 g氢氧化钠，用水定容到100 mL；OPA衍生剂溶液：取0.05 g的OPA，用2 mL甲醇溶解，加入50 μ L乙硫醇，用浓度为0.4 mol/L硼酸钠缓冲溶液定容至10 mL，4℃避光保存。

2.5.2 衍生化方法

用自动进样器设定柱前衍生程序，吸取样液10 μL再吸取10 μL衍生试剂混合，延时2 min后进样。

2.5.3 色谱条件

色谱柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶浓度为0.02 mol/L的乙酸铵缓冲溶液（pH=4）=65∶35（体积比），流速1 mL/min，柱温为30℃，检测波长（紫外检测器）为330 nm。

2.6 精密度与稳定性实验

称取3份配方乳粉，分别按照2.1，2.3，2.4和2.5的方法处理，并按上述色谱条件连续进样6次，测定其峰面积，计算样品中牛磺酸的质量浓度，得到三种不同衍生方法的6次测定结果的相对标准偏差。同时，将2.3.2与2.4.2的最终衍生样品于4℃避光保存，每隔8 h进样一次（10 μL），观察测定时间对测定稳定性的影响。

2.7 回收率实验

移取3份已知牛磺酸质量浓度的配方乳粉，分别加入0.25，1，2 mg牛磺酸标准工作液，根据2.1进行前处理，得到低、中、高3种浓度的牛磺酸混合液，再根据2.3.2，2.4.2与2.5.2的步骤进行衍生并进行测定分析。用外标法计算测定值，通过比较测定值与理论值，分别计算3种柱前衍生方法的回收率。

3 结果与分析

3.1 样品前处理的方法选择

因乳粉中含有大量的蛋白质及脂肪，若不在衍生化前除去，不仅会堵塞色谱柱，而且会影响色谱分离效果。沉降蛋白的方法一是使用蛋白沉淀剂，另一种就是使用有机溶剂如甲醇、乙腈等沉降蛋白。本研究称取奶粉2 g溶解后加蛋白沉淀剂各1 mL，并定容至50 mL，处理样品进行衍生化反应并经检测，色谱峰峰型较好，干扰少。通过样品的加标回收率可以看出，牛磺酸在前处理过程中损失较小。故本研究在处理配方乳粉时选择蛋白沉淀剂沉降蛋白。

3.2 流动相缓冲溶液pH值的选择

调节浓度为0.02 mol/L乙酸铵溶液的不同pH值作为缓冲溶液，分别与甲醇组成流动相。结果表面，在pH值在4.0时，牛磺酸衍生产物的峰形尖锐且无拖尾，故选择流动相中缓冲溶液的pH值为4.0。图1～图3为三种不同柱前衍生方法所获得的色谱图。由图1～图3可以看出，三种衍生方法在此流动相条件下，均能够得到较好的分离，且峰型对称无拖尾。

3.3 线性关系及检出限

按照2.3.3，2.4.3及2.5.3节条件下进行采集数据，分别以标准峰面积对标准工作溶液浓度进行线性回归，得到牛磺酸标准品的线性回归方程、相关系数、线性范围以及检出限，如表1所示。由表1可以看出，通过三种不同柱前衍生方法，牛磺酸在0～100 mg/L范围内均具有良好的线性关系，相关系数均大于0.998，检出限（S/N=3）最低为0.3 mg/L。

3.4 实验方法的精密度与稳定性

按照2.6，分别得到三种柱前衍生方法的连续6次峰面积测定结果，其RSD分别为1.30%，0.84%，0.62%，表明精密度良好。单磺酰氯法和FMOC衍生化后的样品在衍生后的0，8，16，24，36，48 h进样，测定峰面积，RSD分别为1.09%和1.20%，表明单磺酰氯法和FMOC法衍生化后的样品在4℃避光保存的条件下48 h内稳定。

3.5 回收率实验

图2 FMOC法衍生化色谱

由表2可以看出，三种柱前衍生法的高、中、低加标回收率以及相对标准偏差，OPA柱前衍生法的三个水平加标回收率虽然不是最高，但是其相对标准偏差均小于1%，主要是由于OPA柱前衍生法使用仪器编制程序进行衍生并测定，在样品量和时间上都较其他两种手工操作的方法更为精准，但是三种方法的回收率都达到94%以上，且各自的相对标准偏差均小于3%，说明三种柱前衍生法都能够很好的测定样品中牛磺酸的质量浓度。

图3 OPA法衍生化色谱

表1 三种不同柱前衍生方法所得牛磺酸的线性方程、相关系数、线性范围以及检出限

4 结果与讨论

（1）本研究选取了三种常用的衍生试剂单磺酰氯、FMOC、OPA，分别对配方乳粉中的牛磺酸进行柱前衍生并进行测定，良好的分离度以及回收率、稳定性等表明柱前衍生完全能够达到配方乳粉中牛磺酸的检测要求，相比需要昂贵柱后衍生装置的柱后衍生法而言，柱前衍生法更为经济适用，使用范围更为广泛。

（2）三种柱前衍生法，其中OPA衍生样液对于衍生化时间要求比较严格，需在2 min内进样测试，而相对于FMOC、单磺酰氯的衍生样品，在4℃避光保存条件下48 h内稳定，测定时间范围更为宽松。

（3）三种柱前衍生法的前处理都比较简单，除了单磺酰氯衍生法需要2个小时的衍生时间，其余两种方法的衍生化都非常快捷，尤其是OPA柱前衍生法，不仅快捷，而且简单，只要利用自动进样器进行程序设定，就能够完成样品衍生及测定，大大缩减了前处理过程并减小了人为操作的误差。

表2 回收率测定结果

（4）本研究中三种柱前衍生测定配方乳粉中牛磺酸的方法不仅准确、快捷，而且经济、实用，其检出限最低为单磺酰氯衍生法的0.3 mg/L，相对于柱后衍生的1 mg/L[7]的检出限而言，三种柱前衍生法在灵敏度上均高于柱后衍生法；同时，三种柱前衍生法的平均回收率也都高于柱后衍生法的平均回收率95.6%[7]。

综上所述，柱前衍生法有着不可替代的优势，完全能够满足配方乳粉中牛磺酸的检测要求，检测人员可以根据各自实验室条件和实验时间来选择合适的柱前衍生化方法进行牛磺酸的检测。

[1]HAN X B,CHEN X C,PANG Z L.The effect of taurine on human fetal brain cells proliferation in tissue culture[J].Nutrition Research,1992,12(2):179-185.

[2]RICCI L,VALOTI M,SGARAGLI G,et al.Protection by taurine of rat brain cortical slices against oxygen glucose deprivation-and reoxygenation-induced damage[J].European Journal of Pharmacology,2009,621(1/2/3):26-32.

[3]LIU J,LIU L,CHEN H.Antenatal taurine supplementation for improving brain ultrastructure in fetal rats with intrauterine growth restriction[J].Neuroscience,2011,181(5):265-270.

[4]LIN C T,SONG G X,WU J Y.Is taurine a neurotransmitter in rabbit retina[J].Brain Research,1985,337(2):293-298.

[5]白小琼,孔德义.牛磺酸研究进展[J].中国食物与营养,2011,17(5):78-80.

[6]赵振宇,张韻慧.牛磺酸药理作用的研究新进展[J].中国医院药学杂志,2009,29(16):1390-1393.

[7]姜金斗,刘波,郝岩平.HPLC法柱后衍生测定乳制品中牛磺酸的含量[J].中国乳品工业,2003,31(4):47-49.

[8]GB 10765-2010,食品安全国家标准婴儿配方食品.

[9]GB 10767-2010,食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品.

[10]陈申如,胡阳,倪辉，等.高效液相色谱法测定牡蛎中牛磺酸含量[J].中国食品学报,2013,13(02):193-198.

[11]张亮,刘文,郑平安，等.高效液相色谱法快速测定紫贻贝中的牛磺酸[J].食品工业科技,2013,34(04):53-55.

[12]王丽雅,陶宁萍,张恒劼.柱前衍生-高效液相色谱法测定暗纹东方鲀肉中牛磺酸含量[J].食品与发酵工业,2012,38(10):159-164.

[13]GB 5413.26-2010,食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中牛磺酸的测定.

[14]刘柱,陈万勤,王瑾，等.酶解反应-柱前衍生-高效液相色谱法测定高淀粉类食品中的牛磺酸[J].理化检验：化学分册,2013,49(9):1079-1082.

[15]陈向明.2,4-二硝基氟苯柱前衍生-高效液相色谱法测定牡蛎中牛磺酸[J].理化检验(化学分册),2014,50(05):611-613.