酶解与离心分相结晶协同制备抗性淀粉工艺研究

冯军伟 黄继红， 苏雪锋 游 倩 侯银臣 王 文 杨铭乾

（河南工业大学生物工程学院1，郑州 450001）

（郑州市中食农产品加工研究院2，郑州 450001）

酶解与离心分相结晶协同制备抗性淀粉工艺研究

冯军伟1黄继红1，2苏雪锋1游 倩1侯银臣2王 文1杨铭乾1

（河南工业大学生物工程学院1，郑州 450001）

（郑州市中食农产品加工研究院2，郑州 450001）

以抗性淀粉含量和产品收率为评价指标，对耐高温α－淀粉酶添加量单因素优化分析和离心因素对照分析，得到早籼米抗性淀粉的最佳制备工艺条件：耐高温α－淀粉酶量为1.20 U／g，脱支液4 000 r／min离心15min，重相和轻相分别结晶，经洗糖、干燥后得重相抗性淀粉质量分数可达30.69%，收率20.35%，轻相抗性淀粉质量分数可达45.82%，收率67.75%。2种产品对原淀粉总收率88.10%。并分析抗性淀粉碘吸收曲线和聚合度，表明相近聚合度（一定范围内）的直链淀粉分子越集中越利于结晶形成抗性淀粉。该工艺验证并充实了抗性淀粉形成机理假说：本质是直链淀粉分子的结晶，基本满足工业化生产高含量抗性淀粉产品的要求。

早籼米抗性淀粉 离心分相 RS含量与收率评价 聚合度

充分利用我国库存的已不再适宜人们直接食用的低价值早籼稻提取高附加值的淀粉，解决库存谷物严重浪费的问题，再对其进行深加工，得到不同类型和规格的变性淀粉，尤其是高效制备抗性淀粉，是目前迫切需要解决的问题。抗性淀粉（resistant starch，RS）是近年来国际上新兴的食品研究领域。抗性淀粉能降低胰岛素反应，对Ⅱ型糖尿病有缓解作用［1－3］，调节机体能量摄入，控制体重［4－5］，因此在人类键康饮食中具有广阔前景。世界卫生组织等机构1998年联合出版的《人类营养中的碳水化合物》一书中指出：“抗性淀粉的发现和研究进展，是近年来碳水化合物与键康关系研究中的一项重要成果”，高度评价了RS对人类键康的重要意义。

抗性淀粉制备方法有高温压热法、酸法、酶法（单酶法或双酶法）、挤压法或多法相结合，但存在抗性淀粉含量偏低、周期长（反复冻融）、成本高、产品收率低等问题。如李俊伟［6］报道利用挤压法制备大米抗性淀粉的质量分数为8.87%；刘一洋［7］利用酸酶（普鲁兰酶）法制备大米抗性淀粉，其RS质量分数为24.31%；Zhang等［8］报道利用耐高温α－淀粉酶和普鲁兰酶双酶协同法制备玉米抗性淀粉后，又用耐高温α－淀粉酶提纯得到RS质量分数为58.87%抗性淀粉产品。本试验在淀粉经普鲁兰酶脱支之后，结晶之前，将脱支液离心得重相（离心沉淀）和轻相（离心悬浮液），并将其分别结晶。以抗性淀粉含量和抗性淀粉收率双重指标，研究了基于脱支液离心分离再分相结晶的早籼米抗性淀粉制备新工艺，为实现工业化生产高含量的抗性淀粉产品积累了试验依据。并结合抗性淀粉碘吸收曲线和聚合度分析抗性淀粉形成的适宜条件，验证并充实了抗性淀粉形成机理假说。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

早籼米：信阳固始县祖师精米厂；耐高温α－淀粉酶（6 000 U／g）、普鲁兰酶（液体，1 000 U／mL）：河南财鑫集团有限责任公司；抗性淀粉试剂盒：爱尔兰Megazyme公司。

1.2 主要仪器和设备

TH－500梯度混合器：上海沪西分析仪器厂；SHA－C数显水浴恒温振荡器：金坛华峰仪器有限公司；TDZ5－WS多管架自动平衡离心机：河南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 早籼米全粉制备

将早籼米在水中浸泡，然后用锤式旋风磨将湿润的早籼米磨粉，最后60℃鼓风干燥，粉碎待用。

1.3.2 早籼米淀粉制备

2000g早籼米粉溶于6700mL0.1mol／L NaOH溶液，室温搅拌4 h，三足式离心机离心弃上清，将沉淀表层黄色物质刮去后，水洗3次，第3次调pH至中性后离心弃上清液，沉淀60℃鼓风干燥，粉碎待用。

1.3.3 早籼米抗性淀粉制备方法

称取80 g早籼米淀粉于500mL三角瓶中，加255mL水匀浆，调pH 6.2～6.4，然后加入耐高温α－淀粉酶，放入高压蒸汽灭菌器中，121℃处理30min，取出后冷却至55℃，调pH 4.5～5.0后加入普鲁兰酶，55℃水浴中脱支16 h，取出离心（4 000 r／min，10min），重相（底部沉淀为凝胶状）和轻相（上部液相）分别低温（4℃）放置16 h，蒸馏水洗涤后60℃鼓风干燥，粉碎待用。

1.3.4 耐高温α－淀粉酶添加量单因素优化

固定制备工艺中其他条件不变，将压热时耐高温 α－淀粉酶添加量设 0、0.12、0.66、1.20、1.74 U／g 5个水平进行单因素优化试验，每个水平重复3次。

1.3.5 抗性淀粉含量的测定

采用试剂盒AOAO Official Method 2002.02方法测定抗性淀粉含量。

1.3.6 抗性淀粉收率的计算

原料与样品均以干基计算。

抗性淀粉收率＝（抗性淀粉样品干燥质量／淀粉原料质量）×100%

1.3.7 抗性淀粉总含量的计算

抗性淀粉总RS含量＝（W1×重相抗性淀粉RS含量＋W2×轻相抗性淀粉RS含量／样品质量淀粉）×100%

式中：W1为重相抗性淀粉干燥后质量／g；W2为轻相抗性淀粉干燥后质量／g。

1.3.8 抗性淀粉吸收曲线［6，9］

称取20 mg抗性淀粉，加入0.5mL 2mol／L的KOH溶液，使RS充分溶解。加入4mL去离子水，用1mol／L的HCI将pH调至6.0～7.0，加水定容至10mL，取2mL于100mL容量瓶，加入95mL去离子水和2mL I2－KI溶液（2 mg I2／mL和 20 mg KI／mL）。定容至100mL，立即混匀。空白中不加淀粉，其余步骤相同。用紫外分光光度计扫描，波长500～800 nm。记录最大吸收波长。

1.3.9 抗性淀粉平均聚合度的测定

采用还原末端法［10－11］。称取 0.500 g淀粉样品，溶解于2mol／L的KOH溶液中，充分溶解，再用HCl溶液调pH值至中性，定容至50mL。取 1mL溶液用3，5－二硝基水杨酸法测还原末端的数量，得到数据G（以葡萄糖的含量／mg／mL表示），根据下式计算平均聚合度DP。

式中：m为淀粉样品的质量／mg；1.1为淀粉换算成葡萄糖的系数。

2 结果与分析

2.1 耐高温α－淀粉酶添加量对不同规格产品抗性淀粉含量和收率的影响

本试验工艺可得到3种不同规格的抗性淀粉产品，即重相抗性淀粉、轻相抗性淀粉和混合抗性淀粉（将重相抗性淀粉和轻相抗性淀粉粉碎混合即得，此研究表达为抗性淀粉产品总含量和总收率）。每一规格的抗性淀粉产品都分别同时以含量和收率双重指标进行综合评价，研究了耐高温α－淀粉酶添加量对它们的影响（图1）。

图1 耐高温α－淀粉酶量对抗性淀粉收率和RS含量的影响

2.1.1 耐高温α－淀粉酶添加量对重相和轻相抗性淀粉含量的影响

耐高温α－淀粉酶能随机水解淀粉及其降解物内部的α－1，4葡萄糖苷键，使得胶状淀粉溶液的黏度下降，产生可溶性糊精和寡聚糖，过度的水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖。由图1可得：耐高温α－淀粉酶添加量对重相和轻相抗性淀粉含量的影响有着规律的变化。在0～1.20 U／g范围内，2种规格产品的抗性淀粉含量都随着酶添加量的增大而升高，但酶用量大于1.20 U／g时，可能由于酶解过度，2种规格产品的抗性淀粉含量都随着酶添加量的增加而降低。故本试验得出0.12 U／g为耐高温α－淀粉酶的最佳添加量。

Zhang等［8］报道的在0～4 U／g范围内随着耐高α－淀粉酶添加量的增加抗性淀粉含量逐渐增大，上述试验结果与之不相符。原因除了底物原料不同外，还有可能是对脱支液进行离心使脱支酶解液中直链淀粉分子或支链淀粉分子按照分子大小分配，淀粉聚合度较大的淀粉（包括直链以及支链）在底部为沉淀，淀粉聚合度较小的短直链淀粉（更适宜结晶形成抗性淀粉）在上部为悬浮液，且其影响远比耐高温α－淀粉酶的影响显著。抗性淀粉形成本质上是一定聚合度（30～200）的直链重结晶的过程，因此本试验中轻相抗性淀粉质量分数比重相抗性淀粉的高15%～18%。

2.1.2 耐高温α－淀粉酶添加量对重相和轻相抗性淀粉收率的影响

由图1也可得：在0～1.74 U／g范围内，随着耐高温α－淀粉酶量的增加，RS含量较低的重相抗性淀粉收率呈降低的趋势；与此同时以0.12 U／g为界，RS含量较高的轻相抗性淀粉收率呈升高的趋势，大于0.12 U／g轻相抗性淀粉收率开始降低。此结果可能是因为耐高温α－淀粉酶切断α－1，4葡萄糖苷键，使聚合度较高的长链淀粉更多地酶解成聚合度相对低的中短链淀粉，经过脱支液离心环节，淀粉链分子质量分布发生变化，重相相对减少，轻相相对增多。但耐高温α－淀粉酶添加量为1.74 U／g时，淀粉被过度酶解产生少量寡聚糖，不但使淀粉整体被消耗导致重相和轻相抗性淀粉收率都下降，而且使抗性淀粉掺杂有糖成分，所以必须有洗糖环节（洗糖还可以使产品pH达到中性条件，以及洗去其他少量可溶性成分以提高抗性淀粉含量）。因此最佳工艺是耐高温α－淀粉酶添加量为1.20 U／g，重相抗性淀粉质量分数可达30.69%，收率达20.35%，轻相抗性淀粉质量分数可达45.82%，收率达67.75%，产品对原淀粉总收率88.10%。为实现工业化生产高含量抗性淀粉提供了可行的工艺路线。

2.1.3 耐高温α－淀粉酶添加量对抗性淀粉产品总含量和总收率的影响

根据1.3.7计算得到抗性淀粉总含量。同样由图1可得：在0～1.20 U／g范围内，抗性淀粉总含量随着耐高温α－淀粉酶量的增大而升高，但酶用量大于1.20 U／g时，抗性淀粉总含量随着耐高温α－淀粉酶量的增大而降低。再次分析验证了0.12 U／g为本试验耐高温α－淀粉酶的最佳添加量，当酶用量大于1.20 U／g时，会导致过度酶解；也可证明直链淀粉分子是由很多不同聚合度的直链淀粉分子组成，聚合度呈连续的分布［12］，离心作用使其呈现梯度分离，在试验现象上表现为重相和轻相之分。

同时由图1可得：在0～1.74 U／g范围内，随着耐高温α－淀粉酶量的增加，抗性淀粉总收率（重相和轻相抗性淀粉收率之和）呈降低的趋势。这是因为酶解产生可溶性糊精和寡聚糖，过度的水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖，经洗糖流失，导致收率下降。

2.2 抗性淀粉碘吸收曲线

淀粉－碘复合物吸光值法是利用淀粉与碘形成各种有色复合物来研究淀粉中直支链淀粉比例、链长或分子大小，也是直链淀粉含量的一种定性方法。直链淀粉－碘络合物在600～640 nm间呈现最大吸收，而支链淀粉－碘络合物的则为520～560 nm［13］。这种复合物的最大吸收波长、吸收峰的范围和吸光度的变化都与直支链淀粉的比例、直链淀粉的含量和分子量大小等有密切关系。由图2可得知早籼米重相和轻相抗性淀粉的最大吸收波长分别为582和580 nm，且碘吸收曲线在565～630 nm之间呈一较宽的吸收峰，位于支链淀粉－碘络合物、直链淀粉－碘络合物吸收峰范围的中间，但稍偏向直链淀粉吸收峰，表明其可能含有较多的直链淀粉。

图2 抗性淀粉碘吸收曲线

2.3 重相和轻相抗性淀粉平均聚合度分析

淀粉的平均聚合度对抗性淀粉含量影响较大。聚合度太小，直链淀粉分子短，运动比较强烈，扩散速度也较大，因此较难聚集；而聚合度太大，直链淀粉过长，分子间的斥力较大，也难聚集，所以中等适宜的长度才最有利于聚集［14］。把紫外扫描光谱得早籼米重相和轻相抗性淀粉的最大吸收波长582 nm和580 nm代入 Banks公式：1／λmax＝0.001 558＋0.010 25／DP［15］，定性得到重相和轻相抗性淀粉的DP值分别为64.0和61.7；由还原末端法定量检测得重相和轻相抗性淀粉的DP值分别为55.2和40.4。Eerlingen等［16］认为抗性淀粉中淀粉的链长DP值在22～65之间，并且为线状；赵力超等［10－11］曾报道淀粉平均聚合度在20～200范围内，RS含量随淀粉平均聚合度的减小而增大，且DP值在22左右时RS质量分数为99%；上述报道的定性描述和定量分析均与本试验的结果基本相符。2种方法得到的DP值虽有些偏差，但前后结果并不矛盾，结合2.4抗性淀粉碘吸收曲线分析，可初步定性地得出本试验工艺（脱支液离心得重轻相分别结晶）的理论依据：相近DP值（一定范围内）的直链淀粉分子越集中（离心作用）越利于结晶形成抗性淀粉，而之所以轻相抗性淀粉质量分数比重相抗性淀粉的要高15%～18%，还有部分原因可能是脱支液离心后重相（颜色较轻相暗，甚至出现黄色）中含有少量的蛋白质和脂质等杂质，它们的存在影响了重相中直链淀粉分子的结晶。这与目前公认的抗性淀粉形成本质是直链淀粉的结晶假说并不矛盾，而且从另一方面验证并充实了此假说。抗性淀粉主要是由长度适宜的短直链淀粉相互之间通过氢键结合而老化形成的。作为线性高分子，直链淀粉结晶趋势很强，在水溶液中直链淀粉分子快速凝聚并超过胶体尺寸，从而导致沉淀或形成凝胶。

3 结论

基于脱支液离心分离再分相结晶的早籼米抗性淀粉制备新工艺最佳条件为：耐高温α－淀粉酶量为1.20 U／g，121℃压热30min，普鲁兰酶脱支 16 h，脱支液4 000 r／min离心15min，重相和轻相分别结晶，干燥后得重相和轻相2种规格的抗性淀粉产品，其中重相抗性淀粉质量分数可达30.69%，收率达20.35%，轻相抗性淀粉质量分数可达45.82%，收率达67.75%。产品对原淀粉总收率88.10%，该工艺基本上满足实现工业化生产高含量抗性淀粉产品的要求。初步定性地得出本试验工艺的理论依据：相近DP值（一定范围内）的直链淀粉分子越集中越利于结晶形成抗性淀粉。验证并充实了抗性淀粉形成机理假说：本质是直链淀粉分子的结晶。其中DP值范围有待于利用更加准确的方法进行后续试验研究。

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Resistant Starch Prepared by Enzymatic Hydrolysis Cooperated with Phase Separation by Centrifugation

Feng Junwei1Huang Jihong1，2Su Xuefeng1You Qian1Hou Yinchen2Wang Wen1Yang Mingqian1

（College of Biological Engineering，Henan University of Technology1，Zhengzhou 450001）
（Zhongshi Research Institute of Agricultural Products Processing2，Zhengzhou 450001）

The efficient preparation of resistant starch（RS）from early indica rice was studied.α－Amylase amountswere evaluated and comparison of the resistant starch in heavy portion（HRS）and in light portion（LRS）was made by the content and yield of resistent starch.The optimalα－amylase amountwas1.20 U／g.The heavy and light portion were got by centrifuging at4 000 r／min for 15min.Then，the HRSand LRSwere obtained by crystallizing，dissolving and drying，respectively.The contentof resistant starch in heavy resistant starch was30.65% （m／m）with yield coefficient20.35%，while the content of resistant starch in light resistant starch was 45.82%with yield coefficient 67.75%.The total yield coefficient of the two productswas 88.10%.The analysis on iodine absorption curve and degree of polymerization（DP）of two products showed that the amylosemoleculeswith similar DP had a positive relationship with the formation of resistant starch.Basically，tomeet the requirements of industrial production for products rich in resistant starch，this preparation technique verified and developed a hypothesis of RS formation mechanism.

early indica rice resistant starch，separate phase by centrifugation，content and yield evaluation of resistant starch，degree of polymerization

Q814.9

A

1003－0174（2015）06－0049－05

河南工业大学横向项目（151260），河南省产学研合作项目（12210700003）

2014－01－22

冯军伟，男，1988年出生，硕士，发酵工程