鸡基因工程复合抗病毒制剂冻干保护剂的筛选

张代宝，闫若潜，刘 炜，贾松涛

（1.郑州市动物疫病预防控制中心，河南郑州 450015；2.河南省动物疫病预防控制中心，河南郑州 450008）

鸡基因工程复合抗病毒制剂冻干保护剂的筛选

张代宝1，闫若潜2，刘 炜1，贾松涛1

（1.郑州市动物疫病预防控制中心，河南郑州 450015；2.河南省动物疫病预防控制中心，河南郑州 450008）

采用不同高压灭菌条件处理的不同比例的脱脂奶粉、蔗糖、海藻糖以及维生素C组成的保护剂配方对鸡基因工程复合抗病毒制剂进行冻干，冻干后通过外观检查、pH值检测、复水性检测及效价测定比较筛选出了理想的冻干保护剂，之后将普通水剂型和冻干型鸡基因工程复合抗病毒制剂分别置于4℃、-20℃、-70℃条件下进行保存期试验，结果表明采用脱脂奶粉+蔗糖、脱脂奶粉+蔗糖+海藻糖+维生素C两种配方对鸡基因工程复合抗病毒制剂的保护效果最好，冻干后效价仍为220；普通水剂和冻干型鸡基因工程复合抗病毒制剂在-70℃保存条件下保存360天内效价均未降低，普通水剂分别于90天、180天后效价开始明显下降，而冻干型鸡基因工程复合抗病毒制剂的效价均无明显降低，稳定性良好。本研究初步筛选出了鸡基因工程抗病毒制剂的冻干配方，显著延长了其保存期，为鸡基因工程抗病毒制剂规模化生产和推广应用奠定了基础。

鸡基因工程复合抗病毒制剂；冻干；保护剂；保存期

干扰素（interferon，IFN）是由细胞分泌的一类诱生性蛋白质，具有广谱的抗病毒，抑制细胞分裂和免疫调节活性，是一种重要的抗病毒、抗肿瘤治疗药物，也是治疗动物病毒性疫病的重要药物[1-2]。白细胞介素-2（IL-2）是辅助T细胞分泌的淋巴因子，在免疫系统中起着重要的作用，它能促进T细胞、NK细胞、B细胞的分化成熟及激活其生物活性，诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性，还能促进许多淋巴因子如干扰素、肿瘤坏死因子等的合成与释放以及抗体生成，大大增强机体免疫功能。但该类制剂在生产实践的应用中仍有许多问题，比如热稳定性差、不易长期保存和远距离运输等问题。较理想的办法是对其进行真空冷冻干燥，这样不仅可以利用简易条件延长保存期，而且有利于长距离运输。因此，笔者在前期成功构建融合表达和纯化ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的基础上，对以rIFN-α-linker-IL-2重组复合蛋白为主要成份的鸡基因工程复合抗病毒制剂进行了冻干保护剂的筛选和保存期的实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

抗病毒效价为220鸡基因工程复合抗病毒制剂、水泡性口炎病毒（VSV）病毒株由河南省动物疫病预防控制中心技术研究室保存；SPF鸡胚，由乾元浩郑州生物药厂实验室提供；DEME基础培养基及完全培养基由上海拜力生物科技有限公司生产；小牛血清由杭州四季青生物工程有限公司生产；胰酶由上海沪宇生物科技有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 冻干保护剂的准备

分别按照表1、表2、表3的配方和处理条件配置相应的冻干保护剂。

表1 一组冻干保护剂准备

表2 二组冻干保护剂准备

表3 三组冻干保护剂准备

1.2.2 冻干工艺 将准备好的冻干保护剂与鸡基因工程抗病毒制剂按1∶1的比例混合，用滤器（0.22μm孔径）除菌过滤，将抗病毒制剂溶液分装在清洗干净并经高压灭菌处理的青霉素瓶中；分装完成后放进真空冷冻干燥机箱体内，进箱完毕后25℃保持2.5h，使所有产品从25℃同一起点降温到-50℃，并在-50℃保持4h，然后回热到-10℃并保持 1.5h；预冻阶段结束后进行升华，将板层温度控制在-10℃，使产品在-10℃温度维持48h，直到产品中的冻结冰升华完毕 ；解析阶段分多步骤完成：先把温度升到-5℃并维持1h，1h后升温到0℃并维持1h，然后再升温到10℃并维持1h，最后升温到25℃，在该温度和高真空的状况下保持 4h。最后压塞，打开冻干箱，取出产品，压铝盖，完成冻干。

1.2.3 鸡基因工程复合抗病毒制剂冻干制品的检定①冻干后外观、溶解度、pH值检测

检查冻干产品的外形、结构、体积、色泽、质地。溶解度检测是指冻干后产品的返溶于水的能力，冻干干扰素制剂在加入灭菌注射用水后，应迅速溶解，且不含有肉眼可见的不溶物。用酸度计测定pH值，应与冻干前保持一致，范围为6.5～7.5。

②冻干后效价测定

取冻干制剂，以注射用水再溶解，采用微量细胞病变抑制法测定样品的生物活性。主要操作步骤如下：取10日龄SPF鸡胚，外壳消毒后打开气

室，无菌条件下取出鸡胚，放于一次性平皿中；去除头和四肢，剥离内脏，用PBS液洗涤三次；用高压过的小剪子剪碎胚体，用PBS液洗涤三次；加入30 mL DMEM培养基和6 mL消化液，置于37℃的水浴锅中消化20 min，倒掉培养液；加入30 mLDMEM完全培养基，用吸管吹打使细胞均匀散落；取96孔细胞培养板，每孔加入100 μL上述分离的细胞，置于5%CO2、37℃的CO2培养箱中培养24 h。将鸡基因工程复合抗病毒制剂样品作21～220稀释，待细胞长满单层，加入系列稀释的鸡基因工程复合抗病毒制剂样品100μL，每个样品重复4孔，同时作细胞空白对照组和VSV毒对照组，5%CO2、37℃培养24 h后，每孔加入100μL 200 TCID50的VSV病毒稀释液，培养24h左右，观察病变，按照兽药典中的Reed-Muench两氏法判定效价。

1.2.4 鸡基因工程复合抗病毒制剂保存期试验

采用上述筛选出的冻干保护剂配方进行冻干，取冻干型鸡基因工程复合抗病毒制剂和普通水剂，每个4组，分别置于4℃、-20℃、-70℃条件下保存，于15d、30d、60d、90d、180d、360d分别测定样品效价。

2 结果

2.1 冻干后外观、溶解度、 pH值检测结果

白色或微黄色海绵状疏松体结构，质地细腻，均匀分布于瓶底，冻干前后体积不变；加入灭菌注射用水后，迅速溶解，平均复水时间不超过5s，且不含肉眼可见的不溶物；pH值为7.3，与冻干前保持一致。

2.2 冻干后效价测定结果

表4、表5结果显示 ：除了第二组中配方4（10%蔗糖+0.5%海藻糖），采用第二组高压灭菌方法处理得到的冻干保护剂冻干制备的鸡基因工程复合抗病毒制剂效价均高于第一组，这说明冻干保护剂的灭菌处理方式对冻干后制剂效价影响较大，采用110℃，15min的高压灭菌方式对于冻干保护剂的效果更好，并初步筛选除了冻干保护剂的配方和浓度。

表6结果表明：按照配方2、配方4制备的冻干保护剂与鸡基因工程复合抗病毒制剂混合冻干后得到的制剂抗病毒活性最高，表明其冻干保护效果最好；配方1的冻干保护效果稍低于配方3，但配方3中海藻糖价格较高，从规模化冻干的成本和鸡基因工程复合抗病毒制剂的推广应用方面考虑，选取配方2（10%脱脂奶粉+5%蔗糖）作为冻干保护及配方具有价格低廉、便于推广应用的优点。

表4 第一组冻干保护剂冻干后的效价

表5 第二组冻干保护剂冻干后的效价

表6 第三组冻干保护剂冻干后的效价

2.5 鸡基因工程复合抗病毒制剂保存期试验结果

由表7、表8及图1、图2结果表明 ：除了在-70℃条件下，水剂和冻干剂型鸡基因工程复合抗病毒制剂最长放置1年效价仍为220，均无下降，但在4℃和-20℃保存下，普通水剂的效价分别于90、180d后由220降至215、220降至216，开始明显下降；而冻干型鸡基因工程复合抗病毒制剂的效价在-20℃保存360天仍为220，并未下降，仅在4℃保存条件下由180 d的220降至360d的219。这表明所筛选的冻干保护剂配方能够较好地发挥对鸡基因工程复合抗病毒制剂的保护作用，延长鸡基因工程复合抗病毒制剂的保存期。

3 讨论

表7 普通水剂鸡基因工程复合抗病毒制剂不同保存期后效价

图1 不同条件下保存不同时间对水剂型鸡基因工程复合抗病毒制剂效价的影响

表8 冻干型鸡基因工程复合抗病毒制剂不同保存期后效价

图2 不同条件下保存不同时间对冻干型鸡基因工程复合抗病毒制剂效价的影响

冻干过程是一个复杂的相变过程，在预冻、升华、干燥和储存过程中，存在着很多诱导干扰素中蛋白质变性的因素，为保护干扰素中蛋白质、多肽等成分的活性，有利于干扰素冻干制剂成品的成型，在配方中通常添加冻干保护剂来稳定干扰素中的蛋白质。目前，冻干干扰素制剂大都采用人血白蛋白作为保护剂，然而，人血白蛋白存在引起血源性污染（感染乙型肝炎、丙型肝炎和艾滋病的危险）、价格昂贵、需要低温密封保存、 能够在人体内产生抗体、引起部分人过敏等不足之处[3]，所以不少学者近年来在努力寻找其替代物，避免使用人血白蛋白，意图解决上述问题。本研究旨在筛选出一种能安全、成本低、能够替代人血白蛋白的冻干保护剂，从而实现规化冻干和生产，为鸡基因工程复合抗病毒制剂的推广应用奠定基础。

糖是一种最易得、使用最广泛的冻干保护剂，是蛋白质的非特异性稳定剂，在预定、解吸、干燥等多个阶段均能对药物发挥冻干保护作用[4]。本研究中采用的蔗糖和海藻糖都属于二糖，其中蔗糖呈无定型结构，化学性质稳定，能够显著阻止冻干过程中蛋白质二级结构的改变和储藏时内蛋白质的伸展和聚集。蔗糖的玻璃化转变温度相对较高，冻干状态下，它与蛋白质发生共浓缩，从而稀释了蛋白质浓度，防止发生聚合，使药物的分子结构得以维持。另外，海藻糖、蔗糖上的羟基代替部分的结合水与药物分子上的氨基和羰基结合，形成氢键，使其在缺水条件下仍能保持原有蛋白质高级结构不变，从而保持活性[5]。海藻糖的比蔗糖具有更低的吸湿性和更高的玻璃化温度[6-7]，并且不具有还原性，因此冻干保护效果更好，这在本研究也得到了体现：10%脱脂奶粉+5%蔗糖配方的效果稍差于10%脱脂奶粉+5%蔗糖+0.5%海藻糖+0.2%维生素C配方的效果。但考虑到药品成本等方面的因素，10%脱脂奶粉+5%蔗糖配方降低了生产成本，有利于鸡基因工程复合抗病毒制剂在市场竞争中处于有利地位。

本研究所筛选的脱脂奶粉+蔗糖和脱脂奶粉+蔗糖+海藻糖+维生素C配方及采用的冻干剂高压处理方法处理后得到的冻干保护剂可有效保护鸡基因工程复合抗病毒制剂，二者混合冻干后可有效延长制剂的保存期和稳定其效价，为鸡基因工程复合抗病毒制剂的规模化生产和推广应用奠定了基础。

[1] Ion Gresser.The antitumor effects of interferon：A personal history[J]. Biochimie，2007，89（6/7）：723-728.

[2] 杨东亮，林永利.干扰素的研究进展及其在动物临床中的应用[J]. 福建畜牧兽医，2009，31（1）：25-26.

[3] 邹钟诚，苏冬梅，高军等.一种新剂型基因工程干扰素稳定性的研究[J]. 微生物学杂志，2000，20（3）：15-16.

[4] 秦华明，宗敏华，梁世中.糖在蛋白质药物冷冻干燥过程中保护作用的分子机制 [J]. 广东药学院学报，2001，17（4）：305-

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[5] 武华丽，胡一桥，冷冻干燥制剂的稳定性研究进展[J].中国药学杂志，2001，36（7）：436-438.

[6] Hinrichs W L，Prinsen M G，Frijlink H W. Inulin glasses for the stabilization of therapeutic proteins[J]. Int J Pharm，2001， 215（1/2） ：163-174.

[7] 刘传斌，云战友，冯朴荪，等. 海藻糖在生物制品活性保护中的应用前景[J]. 中国医药工业杂志，1998，29（7）：327-331.

（责任编辑：胡藕祥）

Screening of Cryoprotectants for Chicken Genetic Engineering Composite Antiviral Preparations

Zhang Daibao1，Yan Ruoqian2，Liu Wei1，Jia Songtao1
（1.Zhengzhou Animal Disease Control and Prevention Center，Zhengzhou，Henan 450015；2.Henan Animal Disease Control and Prevention Center，Zhengzhou，Henan 450008）

The chicken genetic engineering composite antiviral preparation was freeze-dried with different cryoprotectant prescriptions made up with skim milk，sucrose，trehalose and Vc by means of different autoclaved sterilization. The ideal cryoprotectant was selected through appearance examination，pH measurement，rehydration test and potency test. The aqueous chicken genetic engineering composite antiviral preparation and lyophilized chicken genetic engineering composite antiviral preparation were placed under 4℃，-20℃，-70℃ for preservation period test. The result suggested that the two cryoprotectant prescriptions（skim milk＋sucrose and skim milk＋sucrose＋trehalose＋Vc）could best protect chicken genetic engineering composite antiviral preparation with the antiviral titer of 220. The preservation period test showed that the aqueous chicken genetic engineering composite antiviral preparation and the lyophilized chicken genetic engineering composite antiviral preparation under -70℃ could be preserved for one year with no decline of the titer；while under 4℃ and -20℃，the titers of the aqueous preparation started to decline respectively after 90d and 180d，and the titer of the lyophilized preparation did not decline under -20℃ and decreased a little under 4℃ after 180d. The result indicated that the selected cryoprotectants could remarkably extend the preservation period of the chicken genetic engineering composite antiviral preparation. The study selected the cryoprotectant of chicken genetic engineering composite antiviral preparation，successfully prepared lyophilized chicken genetic engineering composite antiviral preparation with good appearance. It also lay the foundation for the large-scale production of chicken genetic engineering composite antiviral preparation and made some contribution to clinic promotion and application.

chicken genetic engineering composite antiviral preparation；lyophilization；cryoprotectant；preserve period

TB64

A

1005-944X（2015）08-0079-04