兔黏液瘤病快速检测方法的建立

林颖峥，林士佳，宋 青，郭雨雁，包雯骏，熊 炜，李树清，魏晓锋

（1．上海出入境检验检疫局，上海 200135；2．上海实验动物研究中心，上海 201203）

兔黏液瘤病快速检测方法的建立

林颖峥1，林士佳1，宋 青1，郭雨雁1，包雯骏1，熊 炜1，李树清1，魏晓锋2

（1．上海出入境检验检疫局，上海 200135；2．上海实验动物研究中心，上海 201203）

兔黏液瘤病是由兔黏液瘤病毒引起的兔的一种高度接触性、致死性传染病。为了加强口岸对进境野生及实验用兔中兔黏液瘤病的筛查和流行病学调查，本研究建立了PCR和Real-time PCR快速高通量检测兔黏液瘤病的方法，证实两种检测方法具有良好的特异性和灵敏性，适用于兔黏液瘤病的快速检测。

兔黏液瘤病；PCR；Real-time PCR；Taqman探针

兔粘液瘤病（myxomatosis）是由兔粘液瘤病毒引起的一种高度接触性、致死性传染病。该病以全身皮下特别是颜面部和天然孔周围皮下发生粘液瘤性肿胀为主要特征[1]。本病是一种自然疫源性疾病，最早于1896年在乌拉圭发现，随后不久即传播到南美的巴西、阿根廷、哥伦比亚和巴拿马等国家。1930年，此病经墨西哥传入美国加利福尼亚州，目前在美国西部各州呈地方性流行。1950年，澳大利亚为消灭野兔所造成的危害，人为地将黏液瘤病毒引入。1952年，该病传入欧洲，在18个月内传遍了法国、比利时、德国和荷兰等国，并越过英吉利海峡传到英伦三岛，同时斯堪地那维亚和北非国家也有此病的流行。到目前为止，已发生过本病的国家和地区至少有56个。

黏液瘤病毒（myxoma virus）属痘病毒科（Poxviridae）野兔痘病毒属（Leporiuirus genus）[2]。本病有高度的宿主特异性，只发生于家兔和野兔，其它动物不易感。本病的主要传播方式是直接与病兔及其排泄物、分泌物接触或与被病毒污染的饲料、饮水和用具接触。在自然界，蚊子、跳蚤、虱、螨等吸血昆虫是最常见的病毒传播者[3]。兔黏液瘤病全年均可发生，病情严重时死亡率可达100%。该病主要流行于大洋洲、美洲、欧洲诸国。目前检测兔黏液瘤病的方法主要有病原分离鉴定、琼脂免疫扩散试验、补体结合试验、免疫荧光抗体试验、血清中和试验、ELISA方法等。这些传统检测方法受试样本具有一定的局限性，同时操作繁琐且灵敏度较低[4～7]。

我国目前尚未发现本病，但近几年实验研究证明，中国家兔感染兔黏液瘤病毒后的发病率和死亡率均为100%，世界动物卫生组织和我国分别将其列为报告疫病和二类动物传染病。随着对国外各种种兔及兔产品原料等的引入，我国养兔业引入该病的潜在威胁很大，一旦传入，该病所造成的危害和经济损失将无法估量。为了加强口岸对进境野生及实验用兔中兔黏液瘤病的筛查和流行病学调查，本研究建立了PCR和Real-time PCR快速高通量检测兔黏液瘤病的方法，并对所建立的兔黏液瘤病核酸检测方法的特异性和灵敏性进行了评估。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Trizol购自Invitrogen公司；DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；Taq酶、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、随机引物、DNA Marker（DL2000）购自TaKaRa公司。

1.2 病毒样品来源及处理

兔黏液瘤病毒阳性组织样品、血清和细胞培养物来自上海实验动物研究中心。阳性组织样品加等体积生理盐水研磨成匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检。本研究使用的其他病毒如兔病毒性出血症病毒、兔痘病毒、兔纤维瘤病毒、兔轮状病毒、兔水疱性口炎病毒来自上海实验动物研究中心。根据病毒核酸性质，上述病毒样品分别经核酸分离提取制备成DNA或cDNA模板备用。

1.3 PCR检测

针对兔黏液瘤病毒的融合糖蛋白（fusion glycoprotein）基因设计PCR引物，其扩增基因片段大小为431 bp，其上游引物：5' -AGA ACA TAG ACA TAG ACG ATC TGA CC- 3'，下游引物：5' -GCA GAA TAC GTG ATT GCA GTG AGA- 3'。在PCR薄壁管中，加模板2 μL、10×Taq酶浓缩缓冲液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水补足总体积至25 μL。将PCR管置PCR仪上，按如下程序扩增：首先94℃预变性3min；然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸 40s，35个循环；最后72℃延伸3min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍摄。

1.4 Real-time PCR引物和TaqMan探针

使用Vector NTI Suite软件分析不同国家和地区分离的兔黏液瘤病毒基质蛋白（matrix protein）基因的保守序列，用Primer Express软件设计引物和TaqMan探针，上游引物：5' -AAA GGA GAG GAA TGC GCC ATA T- 3'，下游引物：5' -CAC GCC GAA GAA ACT ACT CTT AAT G- 3'，TaqMan探针：5' -ACC CGT ATA CGC CAA AC- 3'，其中TaqMan探针的5' 端标记FAM，3' 端标记MGB。引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成，引物和探针的浓度均为25 μmol/L。

1.5 Real-time PCR检测

采用ABI公司ViiA7荧光PCR仪。反应体系：10×Taq酶浓缩缓冲液2.5μL、dNTP 0.5μL、Taq酶0.25μL、模板1μL、上下游引物各0.25μL、TaqMan探针0.25μL，加水补足总体积至25μL。反应条件：首先95℃预变性3min；然后95℃15s，58℃ 45s，40个循环，每个循环第二步收集荧光信号。

2 结果

2.1 PCR和Real-time PCR检测兔黏液瘤病毒的特异性试验

针对兔黏液瘤病毒保守基因序列，设计引物和探针，分别建立PCR和Real-time PCR检测方法，并使用不同兔病毒（如兔病毒性出血症病毒、兔痘病毒、兔纤维瘤病毒、兔轮状病毒、兔水疱性口炎病毒）作为对照，测试这两种检测方法的特异性。结果显示，经PCR检测，仅有兔黏液瘤病毒阳性样品出现条带单一的特异性基因扩增，其他对照病毒样品均呈阴性（图1）；经Real-time PCR检测，兔黏液瘤病毒阳性样品在10～12个循环处出现显著扩增，对照病毒样品未见扩增（图2）。

2.2 PCR和Real-time PCR检测兔黏液瘤病毒的灵敏性试验

为测试所建立的PCR和Real-time PCR方法的灵敏性，将兔黏液瘤病毒阳性样品DNA进行

定量并梯度稀释，制备浓度分别为10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/ μL、10fg/μL、1fg/μL的模板，再分别用建立的两种方法进行检测。结果显示，PCR检测兔黏液瘤病毒阳性样品DNA模板的下限量为100～10pg（图3），而Real-time PCR检测兔黏液瘤病毒DNA模板的下限量为100～10fg（图4）。

图1 PCR检测兔黏液瘤病毒的特异性

图2 Real-time PCR检测兔黏液瘤病毒的特异性

图3 PCR检测兔黏液瘤病毒的灵敏性

图4 Real-time PCR检测兔黏液瘤病毒的灵敏性试验

3 讨论

兔黏液瘤病毒是感染兔的主要病原之一，其危害严重，一旦感染较难从兔群中清除，影响实验动物质量，干扰实验结果，是实验动物养殖和使用中重点防范的疫病。数十年来，学者们对兔黏液瘤病毒的病原学特性和诊断方法进行了深入研究。将兔黏液瘤病毒感染动物病料接种11～13日龄SPF鸡胚绒毛尿囊腔进行病毒分离鉴定，是诊断兔黏液瘤病最传统、最经典的方法，但该方法比较耗时、繁琐，且本病与兔纤维瘤病毒病原学形态极为相似，很难进行区分[3]；琼脂免疫扩散试验是出入境检验检疫行业标准检测兔黏液瘤病所采用的方法，但被检样品只能是全血或血清，相对局限[7]；补体结合试验是检测兔黏液瘤病经典方法之一，但补体滴度直接影响检测质量且结果判定的主观性较强；免疫荧光抗体试验是检测兔黏液瘤病的方法之一，其敏感性高，但需要配置荧光显微镜[6]；血清中和试验验检测兔黏液瘤病，要求活的病毒及细胞培养，要求严格的无菌环境，过程较长，比较麻烦；ELISA方法是检测兔黏液瘤病常用的血清学方法，其敏感性高、操作简便，但也仅能检测血液样本，无法直接检测动物组织样本和体液，无法在兔黏液瘤病毒感染早期进行诊断。

鉴于血清学检测方法的局限性，同时为了满足口岸对大量野生、实验用兔及兔产品入境快速

检疫的需要，本研究针对兔黏液瘤病毒基因的保守序列，建立了PCR和Real-time PCR快速核酸检测方法，并证实PCR方法能有效扩增兔黏液瘤病毒的特异性基因片段，未发现阳性样品漏检和阴性样品误检，Real-time PCR方法检测阳性和阴性样品荧光信号区分显著。将两种检测方法的灵敏性进行对比，证实Real-time PCR方法的检测下限比PCR方法提高了3个数量级，由于兔黏液瘤病毒隐性感染率较高，采用灵敏度高的检测方法有助于提高隐性感染的检出率，做到早发现、早隔离，从而尽可能降低损失，控制兔黏液瘤病的传入及传播。此外，与PCR方法相比，Real-time PCR方法检测周期更短、操作更简便，适合用于兔黏液瘤病疫情的快速高通量筛检。

总之，本研究重新设计了兔黏液瘤病毒特异性的引物和荧光探针，并创新性的将PCR和Realtime PCR两种核酸检测方法互补应用于兔黏液瘤病的检测，这有助于缩短检疫周期、提高阳性检出率，降低兔黏液瘤病传入我国的风险。

[1] 殷震，刘景华. 动物病毒学[M]. 2版.北京：科学出版社，1997：966-969.

[2] 蔡宝祥. 家畜传染病学[M]. 4版.北京：中国农业出版社，2001：373-375.

[3] 姜骞. 兔粘液瘤病[J]. 畜牧兽医科技信息，2003，19（10）：51-52.

[4] 呼延含蓉，李晓慧，宫江，等. 兔粘液瘤病的研究进展[J].吉林畜牧兽医，2008，29（8）：16-17.

[5] 张宪帮. 兔粘液瘤病的诊断及预防[J]. 养殖技术顾问，2013（12）：206-206.

[6] 李晓福，赵宏伟. 兔粘液瘤病的血清学诊断[J]. 养殖技术顾问，2014（10）：88-89.

[7] 农业部兽医局. NY/T 547—2002 兔粘液瘤病琼脂凝胶免疫扩散试验方法[S]. 北京：中国标准出版社，2002-08-27.

（责任编辑：胡藕祥）

Establishment of PCR and Real-time PCR Assays for Rapid Detection of Myxoma virus

Lin Yingzheng1，Lin Shijia1，Song Qing1，Guo Yuyan1，Bao Wenjun1，Xiong Wei1，Li Shuqing1，Wei Xiaofeng2
（1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135；2.Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203）

Myxomatosis is an highly contagious and lethal disease caused by myxoma virus. In order to survey and investigate the epidemic character of myxomatosis transmission among wild and experimental rabbits，PCR and Realtime PCR assays using TaqMan probe to detect myxomatosis were established and proved to be of high specifi city and sensitivity，suitable for rapid detection of myxomatosis.

myxomatosis；PCR；Real-time PCR；TaqMan probe

S852.65+9.1；S858.291

A

1005-944X（2015）08-0072-04

上海出入境检验检疫局科研专项（编号HK001-2014）。