光气中毒致肺泡上皮细胞线粒体结构和功能损伤的研究

龙 子，孔德钦，海春旭，*，王 欣，*

（1. 第 四军医大学学员一旅四营十三连，陕西 西安 710032；2. 第 四军医大学军事预防医学院毒理学教研室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，陕西 西安 710032）

光气中毒致肺泡上皮细胞线粒体结构和功能损伤的研究

龙 子1，孔德钦2，海春旭2，*，王 欣2，*

（1. 第 四军医大学学员一旅四营十三连，陕西 西安 710032；2. 第 四军医大学军事预防医学院毒理学教研室，陕西省自由基生物学与医学重点实验室，陕西 西安 710032）

光气作为一种无色窒息性化学毒剂，又名碳酰氯或二氯碳酰，分子式为COCl2，是重要的军用化学战剂［1］。 光气也是一些化工产品合成的重要原料，广泛用于农药、制药、塑料、涂料、染料及纺织品等生产领域中。由于其挥发温度低（7.9 ℃）、反应快速、分散度高等特点，在生产、运输、管理过程中会出现意外泄漏，如若防护不当，常可导致人员中毒及伤亡的严重公共事件。肺脏是光气攻击损害的主要靶器官，大剂量光气中毒可造成动物急性肺损伤、肺水肿，严重时发展成为急性呼吸窘迫综合征，导致光气中毒死亡［2-4］。线粒体是细胞内的一种非常重要的细胞器，在能量代谢和信号通路传导等方面发挥重要作用［5-6］。本研究中我们通过构建光气中毒大鼠模型，探讨光气中毒对线粒体的结构和功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物购自第四军医大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（军）2013-0008。光气由本教研室化学方法（40%固体三光气溶于环已烷，二甲基甲酰胺滴定产生）制备。BCA蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司。戊巴比妥钠、NADH、牛血清白蛋白（BSA）和三磷酸腺苷（ATP）等购自Sigma公司。其他常规试剂为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及染毒方法 30只SD大鼠（SPF级），雄性，6～8周龄，体质量180～220 g，随机分为正常对照组和染毒组，每组15只。正常对照组以空气为对照。根据课题组以往的研究基础［7-8］，染毒组给予光气动态染毒（10 g/m3），染毒5 min，构建光气致急性肺损伤模型。动物于染毒后2 h，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，处死全部大鼠，分别采集样本进行检测。将其中6只大鼠的整个肺离体后立即称湿重，80 ℃烘干48 h后称干重，计算湿/干比。

1.2.2 HE染色检测 取余下9只大鼠的左肺上叶，漂浮固定于10%中性缓冲福尔马林液中48 h后常规脱水、透明、包埋，在Leica RM2135型轮转式切片机上制备4µm切片，进行HE染色。

1.2.3 透射电镜观察 取9只大鼠左肺下叶，组织块约1 mm3大小，加入3%戊二醛4 ℃固定3 h，交由电镜室制作透射电镜标本。镜下观察、拍照，重点观察线粒体微观改变。电镜下对肺泡上皮细胞线粒体进行半定量分析。相同放大倍数下随机选择5个视野照相，每个视野中随机选取约20个线粒体进行分析。每只动物对100个线粒体进行分析。按照线粒体的受损程度，逐个将线粒体进行0～4级记分（级别越高损伤程度越重），最后计算平均分数。

评分标准：0分为正常；1分为结构基本正常，基质颗粒丢失（轻度肿胀，基质密度减少，嵴分离）；2分为线粒体肿胀（基质密度严重减小，嵴分离），基质透明，嵴未断裂；3分为线粒体嵴断裂，基质凝固（严重肿胀）；4分为内外膜完整消失，呈空泡状（严重肿胀伴嵴断裂，内外膜破裂）。

1.2.4 制备肺脏组织线粒体悬液 采用改良的分离介质，迅速取出9只大鼠的右肺组织，按1∶9（m/V）加入带有冰渣的分离介质（0.25 mol/L蔗糖，0.05 mol/L甘露醇，1 mmol/L 乙二胺四乙酸，10 mmol/L 氨基丁醇，pH 7.5），电动匀浆器匀浆（5 000 r/min离心1 min），制成10%的肺组织匀浆液。然后将匀浆液于600 r/min低速离心10 min，取上清；再以1 600 r/min离心5min，取上清；最后12 500 r/min离心10 min，留沉淀，即为线粒体；沉淀用分离介质5 mL再次悬浮，12 500r/min离心10 min后得到的沉淀为提纯的线粒体。往沉淀中加入1 mL分离介质制成线粒体悬液，用BCA法测定蛋白含量。

1.2.5 线粒体呼吸链复合酶活力测定 所有测定均在25 ℃条件下进行，用酶促一级反应的初速度来计算酶活力［9］。①复合物I的测定：在样品杯中加入0.2mol/L，pH7.4的PBS 1.5 mL，10 mmol/L铁氰化钾0.3mL，线粒体悬浮液0.03 mL，0.1 mol/L氰化钾0.05mL，用双蒸水补充体积至2.97 mL，加入0.1 mol/L NADH （用10 mmol/L Tris配制） 30 μL作为起动剂，在420 nm波长处进行检测。空白杯中用同体积分离介质代替线粒体悬浮液，不加NADH，其余加入试剂均同样品杯。单位定义：每毫克线粒体蛋白每分钟消耗的NADH的物质的量。氧化型辅酶I的克分子消光系数E420=1.033 mmol/（L·cm）。②复合物II的测定：根据2，6-二氯酚靛酚钠盐在600 n m处吸光度的减少进行测定。肺组织匀浆悬于25 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.5）中，分别在不同浓度的琥珀酸盐、加入艾地苯醌或吩嗪硫酸甲酯作为电子受体、不同浓度的艾地苯醌、加入或不加常用的佐剂——BSA和ATP这4种条件下进行测定。从加入艾地苯醌反应开始进行，3 min内吸光度持续下降，复合物II活性的特异性通过加入特异性抑制剂丙二酸（5 mmol/L） 或 2-噻吩甲酰三氟丙酮（500µmol/L） 后的抑制率来测量。③复合物 II+III的测定：在样品杯中加入0.2 mol/L， pH7.4的PBS 1.5 mL，3mmol/L EDTA-K 0.3 mL，0.1 mmol/L氧化型细胞色素C（cytC） 0.1 mL，0.1 mol/L氰化钾0.05 mL，线粒体悬浮液0.03 mL，用双蒸水补充体积至2.97 mL，加入0.1mol/L NADH （用10 mmol/L Tris配制） 30 µL作为起动剂，在550 nm波长处进行检测，空白杯中用同体积分离介质代替线粒体悬浮液，除不加NADH外其余加入试剂均同样品杯，单位定义：每毫克线粒体蛋白每分钟还原cytC的物质的量。复合物II+III的活性减去复合物II的活性，即得复合物III的活性。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 光气染毒后肺湿/干比值的变化

光气染毒2 h后，与阴性对照组相比，光气染毒组大鼠的肺湿/干比值明显升高（P＜0.01），见图1。

2.2 光镜下肺脏HE染色观察

肺组织HE染色检查结果如图2。阴性对照组大鼠细支气管结构和肺脏未见异常。肺泡腔中无红细胞渗出，肺泡腔与肺泡隔完整（图2A）。与对照组相比，光气染毒后，大鼠肺泡腔可见大片出血样改变，大量红细胞和炎性细胞聚集于肺泡壁周围，肺泡壁增厚，肺泡壁边缘不规整，肺泡腔有明显的渗出物样物质，血管内有许多凝聚的细胞（图2B）。

2.3 肺组织超微结构观察

光气染毒后，透射电镜观察结果显示：正常对照组，Ⅱ型肺泡上皮细胞结构完整，线粒体轮廓正常，基质密度致密、均匀；线粒体嵴完整，内质网排列有序（图3A和B）。I型肺泡上皮细胞表面光滑、气血屏障结构完整，内皮结构正常，肺泡腔未见明显的红细胞和渗出物（图3C和D）。正常对照组线粒体损伤评分为0分。

光气染毒组肺Ⅰ型细胞表面不完整，基质出现大小不等的空泡，细胞核边集，出现凋亡样改变（图4A）。肺Ⅱ型细胞核边集，线粒体变少，形态发生改变，细胞内出现渗出物。部分线粒体内膜完整性消失，基质透明，多数线粒体呈空泡状，严重肿胀伴嵴断裂，内膜破裂，线粒体损伤评分为4分（图4B和C）。腔内泡状突起减少（或消失），肺组织充血与水肿明显，气血屏障受损，内质网扩张，排列紊乱（图4D）。腔内可见大量纤维状渗出物，气血屏障受损（图4E）。线粒体严重肿胀、嵴断裂，部分呈现空泡状，排列紊乱，基质凝固，线粒体损伤评分为4分，同时，板层小体呈巨大空泡样变化（3分）（图4F）。染毒组肺组织线粒体损伤评分为（3.7±0.5）分。

2.4 线粒体复合物活性

在光气染毒2 h后，测定肺组织线粒体氧化呼吸链酶复合物的活性，反映细胞的呼吸链功能发生的变化。与阴性对照组相比，光气染毒组线粒体复合物Ⅰ、复合物Ⅱ和复合物Ⅲ活性均明显降低（P＜0.05）。见图5。

3 讨 论

光气是一种窒息性剧毒气体，吸入后主要通过导致肺水肿引起中毒。目前，光气导致肺水肿的机制还不完全清楚［10］，其中毒主要有以下几个特点：①毒性作用特别强，往往能够引起严重的急性呼吸道损伤，特别是导致肺水肿，造成急性呼吸窘迫综合征［11］；②反应速度特别快，在很短的时间内产生毒性，一般不具有遗传毒性和致癌性；③分散度较高，使其在空气中漂浮时间较长，导致接触暴露的机会增加，发生中毒的概率增加；④军民两用，光气作为化工原料、产品或副产物广泛存在于生活和生产中，突发事故或恐怖活动都可以导致光气中毒［12］；⑤防治困难，目前光气中毒还缺乏有效的救治药物，迫切需要寻找新的中毒靶点，指导有效药物的研发［10］。

本课题组以往的研究发现，继发氧化损伤在光气中毒中发挥重要作用［13］。线粒体是细胞内的一种非常重要的细胞器，在能量代谢和信号通路传导等方面发挥重要作用。线粒体是细胞内活性氧生成的主要部位，也是氧化损伤的主要靶点［14］。本文重点研究了光气对线粒体结构和功能的影响。研究发现，光气染毒后，不仅存在炎细胞浸润，更重要的是肺Ⅰ型、Ⅱ型上皮细胞受到破坏损伤，透射电镜检测可以看到，线粒体明显肿胀，形态改变，甚至固缩溶解，数量减少，线粒体嵴断裂和缺失；线粒体复合物受损，活性降低，表明光气中毒后的毒性作用靶点是线粒体，出现了线粒体结构和功能异常。本课题组以往研究已发现，光气中毒可以导致线粒体ATP酶活性降低［15］。综上所述，光气导致线粒体结构和功能受损，引起ATP合成障碍，细胞的稳定性、顺应性降低，严重破坏细胞的修复功能，如不能及时阻断，就会不可逆转地导致动物肺组织坏死，失去功能。本实验结果表明，肺泡上皮细胞线粒体损伤为光气中毒损伤的主要毒作用靶点，为光气中毒防治提供了新思路。

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Study on phosgene-induced damage of pulmonary mitochondria

LONG Zi1，KONG Deqin2，HAI Chunxu2，*，WANG Xin2，*
（1. The Thirteenth Company， the Fourth Battalion， First Brigade，Fourth Military Medical University， Xi’an 710032； 2. Shaanxi Key Lab of Free Radical Biology and Medicine， Department of Toxicology， School of Preventive Medicine， Fourth Military Medical University， Xi’an 710032， Shaanxi， China）

目的： 研究光气中毒对肺泡上皮细胞线粒体结构和功能的损伤作用。方法：30只SD大鼠随机分为正常对照组和染毒组，每组各15只。正常对照组以空气为对照。染毒组给予光气（10 g/m3）动态染毒5 min，构建光气致急性肺损伤模型。染毒后2 h麻醉，采集肺组织样本，测定肺组织湿/干比，进行肺组织病理检测和电镜观察，并测定肺组织线粒体酶复合物活性。结果：与对照组比较，光气染毒后，肺湿/干比显著增加（P＜0.01），肺组织存在炎细胞浸润和肺泡上皮细胞损伤；线粒体明显肿胀，形态改变，甚至固缩溶解，数量减少，线粒体嵴断裂和缺失，线粒体酶复合体活性降低（P＜0.05）。结论：肺泡上皮细胞线粒体损伤为光气中毒的主要毒作用靶点之一，本研究结果为光气中毒防治提供了新思路。

光气；急性肺损伤；线粒体；中毒

OBJECTIVE:To study the toxicological effects of phosgene on pulmonary mitochondria.METHODS：30 SD rats were randomly divided into two groups，with 15 in each group. The rats in control group were exposed to air. The rats in phosgene group were exposed to 10 g/m3phosgene for 5 min. Two hours after exposure，pulmonary tissues were collected，HE staining and transmission electron microscope were used to identify histological changes. Activities of mitochondrial complexes were determined.RESULTS：Phosgene induced a significant increase of pulmonary wet/dry ratio. After phosgene poisoning，there were profuse neutrophil infiltration and pulmonary alveoli epithelial cell damage. Mitochondria were notably swollen，and even appeared contracted and dissolved. The number of mitochondria was significantly decreased. Mitochondrial ridge was broken and absent. The activities of mitochondrial complex were significantly reduced.CONCLUSION：Mitochondria were main targets of phosgene poisoning，and the results provided basis for the development of new drugs in the treatment of phosgene poisoning.

phosgene；acute lung damage；mitochondria；poisoning

R994.7

A

1004-616X（2015）01-0054-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.012

2014-10-03；

2014-12-25

军队青年基金资助（13QNP124）

作者信息：龙 子，E-mail：zi_long11@163.com。*通信作者：海春旭，E-mail：Cx_hai@fmmu.edu.cn；王 欣，E-mail：x inwang@fmmu.edu.cn