抗炎因子TSG-6抑制兔耳瘢痕增生的实验研究

王 晖，李小静，陈

抗炎因子TSG-6抑制兔耳瘢痕增生的实验研究

王 晖，李小静，陈

目的通过建立兔耳增生性瘢痕模型，研究肿瘤坏死因子α刺激基因-6（TSG-6）在增生性瘢痕形成过程中的作用及机制。方法建立兔耳增生性瘢痕模型，右侧耳创面为实验组，注射TSG-6，左侧均注射等量PBS作为对照组，通过比较各组瘢痕指数（SEI）及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的不同来评价瘢痕增生程度的差异。采用免疫组化法及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在各组中的表达；以透射电镜观察及TUNEL法检测瘢痕组织成纤维细胞凋亡的变化。结果与PBS对照组比较，TSG-6治疗组炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α表达减少炎症反应明显减轻，瘢痕组织成纤维细胞凋亡明显增多，且SEI及Ⅰ、Ⅲ型胶原含量均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论抗炎因子TSG-6能明显减弱增生性瘢痕的形成，其对瘢痕形成的抑制作用可能与抑制炎症反应及促进成纤维细胞凋亡相关。

动物模型；增生性瘢痕；兔；炎症；TSG-6

肿瘤坏死因子α刺激基因-6（tumor necrosis factor α stimulated gene 6，TSG-6）是肿瘤坏死因子α诱导蛋白-6（tumor necrosis factor alpha induced protein，TNFAIP6）的编码基因，是在筛选肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）干预的人纤维细胞cDNA表达文库时发现的一个新基因，其表达可被TNF-α和白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等许多信号分子诱导［1－2］。由于基因启动子序列中存在激活物蛋白1和核因子白细胞介素结合位点，TNF-α、IL-1等促炎因子刺激后，该基因在成纤维细胞中表达显著增高，因此被认为是一个受TNF-α调节的、参与多种炎性反应的基因。TSG-6基因编码蛋白含277个氨基酸，属透明质酸（hyaluronic acid，HA）结合蛋白家族，主要由相邻的连接组件和CUB组件组成，可与HA、硫酸软骨素、蛋白多糖以及蛋白聚糖的G1链结合［3］。Tan et al［4］实验证实抗炎因子TSG-6在瘢痕疙瘩、正常瘢痕和无瘢痕皮肤中的差异分布。然而，TSG-6对瘢痕组织形成的影响未见报道。该研究以兔耳瘢痕模型为基础观察TSG-6局部创面注射对增生性瘢痕形成的影响，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂rhTSG-6购于美国R＆D Systems公司，Ⅰ型、Ⅲ型胶原及TNF-α抗兔抗体购于美国Biorbyt公司，兔白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）抗体、兔白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗体购于美国Bioss公司，二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）购于美国Thermo Fisher Scientific公司，原位细胞凋亡检测试剂盒购于美国Trevigen公司，逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）引物设计合成于上海捷瑞生物工程有限公司，逆转录试剂盒、RT-PCR扩增试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 兔耳瘢痕模型的建立及用药选用健康成年新西兰大耳兔6只（购自安徽医科大学实验动物中心），雌雄不拘，体重2.5～3.0 kg，分笼饲养。兔耳瘢痕模型的制作参照Morris et al［5］方法：用3%戊巴比妥钠30 mg／kg进行耳缘静脉麻醉，严格无菌操作条件下，选取兔耳腹侧面远离耳根部位无毛或少毛区，沿长轴避开可见血管，以角膜环钻在兔耳腹侧作直径为7 mm创面，去除兔耳全层皮肤并刮除软骨膜，每只兔耳作6个相同创面，共计72个创面，术后创面暴露。选择兔右耳瘢痕作为TSG-6实验组，兔左耳瘢痕为PBS对照组。1 μg TSG-6予10 μl PBS溶解后用微量注射器分别于术后当天及术后5、10、15 d进行右侧耳创面局部注射，左侧兔耳创面同时注射等量PBS作对照。术后26 d，3%戊巴比妥钠做耳缘静脉麻醉，切取标本。用作HE、免疫组化染色的标本置于4%中性甲醛中固定，其余均用深低温冰箱－80℃保存。

1.3 方法

1.3.1 HE染色 标本行4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水；二甲苯透明；常规石蜡包埋、切片、HE染色；光镜观察并摄片。瘢痕增生程度以光镜下测量的瘢痕指数（scar elevation index，SEI）［5］表示。

1.3.2 透射电镜观察 标本行2.5%戊二醛4℃预固定2 h；PBS缓冲液漂洗3次；1%锇酸4℃后固定2 h；常规电镜样品脱水、浸透、包埋、超薄切片和铀铅染色；透射电镜观察并照相。

1.3.3 免疫组化染色 各组兔耳病理性瘢痕组织石腊切片入梯度乙醇溶液中脱蜡；水化；PBS（pH 7.4）冲洗；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶；枸橼酸钠缓冲液热抗原修复；小牛血清封闭；一抗分别为Ⅰ型、Ⅲ型胶原及TNF-α抗兔抗体和兔IL-1β抗体、兔IL-6抗体；DAB显色；苏木精复染；中性树胶封片。已知阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。显微镜观察并拍照。

1.3.4 TUNEL法检测细胞凋亡情况 实验操作参照原位凋亡检测试剂盒说明书进行，基本步骤如下：各组兔耳病理性瘢痕组织石腊切片置于梯度乙醇溶液中脱蜡，水化，PBS（pH 7.4）冲洗，20 μg／ml蛋白水解酶K（10 mmol／L Tris／HCl，pH 7.4）室温下消化30 min，PBS漂洗切片2次，吸干样品周围水分，滴加50 μl TUNEL反应混合液（阴性对照滴加50 μl标记液），湿盒内37℃避光孵育60 min；PBS漂洗玻片3次，样品直接或封片后显微镜观察。染色区域位于细胞核，光镜下观察正常的成纤维细胞细胞核呈蓝色，为阴性反应，凋亡细胞的细胞核呈深浅不一的棕褐色，为阳性反应，即凋亡细胞。在高倍镜（× 400）视野下，每张切片选择5个阳性视野，每个视野计数100个成纤维细胞中的阳性细胞数，计算平均阳性细胞数所占的百分比，即凋亡指数。

1.3.5 RT-PCR检测炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表达 将冻存的瘢痕组织放入研钵中加入液氮研磨，加入TRIzol后经过震荡、离心将提取出的RNA沉淀溶于0.1%焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水中，用紫外分光光度计分别检测260、280 nm处吸光度（absorbance，A）值（A260、A280），并计算RNA浓度。逆转录反应参照逆转录试剂盒说明严格执行。扩增引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成，见表1。

扩增条件：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃终末延伸8 min，共35个循环。最终获得产物经2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统对图像进行分析，测定条带光密度值，以β-actin作比较计算炎症因子相对mRNA比值，并行统计学分析。

1.4 统计学处理采用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据以±s表示，两组之间数据比较采用t检验。

2 结果

2.1 大体观察术后3 d死亡1只，剩余5只，全部纳入实验分析，创面均于术后12～14 d完全愈合，PBS对照组的30个创面模型中，术后21 d左右，瘢痕组织逐渐高出皮肤，呈现淡红色，术后26 d，30个创面共形成增生性瘢痕24个，占80.0%，瘢痕增生明显高出皮面且有挛缩现象。PBS对照组瘢痕块颜色较红，质地较硬，瘢痕高出皮肤平面，增生范围未超出原创缘；TSG-6实验组瘢痕颜色淡，质地较柔软。

2.2 TSG-6与瘢痕增生显微镜下用测微尺进行测量并计算瘢痕指数，TSG-6实验组瘢痕指数为（1.92±0.15），PBS对照组瘢痕指数为（1.29± 0.18），两组比较差异有统计学意义（n＝12，t＝9.31，P＜0.01）。免疫组化染色结果显示TSG-6实验组Ⅰ型、Ⅲ型胶原沉积明显较PBS对照组减轻。见图1。

2.3 TSG-6与细胞凋亡透射电镜形态学观察可见TSG-6实验组细胞凋亡显著，细胞内可见核固缩线粒体肿胀及凋亡小体等，而PBS对照组细胞内未见明显凋亡表现。见图2。TUNEL半定量检测分析发现TSG-6实验组凋亡指数为（0.42±0.05），明显高于PBS对照组（0.30±0.03），差异有统计学意义（n＝12，t＝7.13，P＜0.01），见图3。结果证实TSG-6实验组细胞凋亡显著。

2.4 TSG-6与炎症反应免疫组化染色显示TSG-6实验组IL-1β、IL-6及TNF-α表达较PBS对照组显著。见图4。所有提取RNA样品A260／A280比值均在1.8～2.0，说明标本提取RNA纯度较理想，RTPCR半定量检测证明3种炎症因子于TSG-6实验组表达均明显低于PBS对照组。见表2。结果提示TSG-6具有抑制炎症因子释放，抑制炎症反应的作用。

表2 两组瘢痕组织IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA相对定量值（n＝12，±s）

与PBS对照组比较：*P＜0.05

组别IL-1βIL-6TNF-α TSG-6实验0.675±0.009*0.585±0.029*0.596±0.013*PBS对照0.756±0.0360.624±0.0200.618±0.012

3 讨论

皮肤创伤愈合一般经历炎症、增殖和成熟或重塑3个阶段。炎症反应可作为抗感染的免疫屏障，同时刺激纤维蛋白合成以闭合创面。因此，适度的炎症反应有利于创面愈合，然而过度炎症反应将导致病理性瘢痕的形成。TSG-6是已被证实的具有明显抗炎作用的细胞因子。它可以抑制炎症因子IL-6、IL-1β等的表达、抑制中性粒细胞浸润、减少炎性损伤，从而保护角膜免受化学及机械损害［6］；在关节炎鼠模型中，TSG-6可使炎症局限，明显减轻关节水肿，软骨和骨质破坏得到很好地控制［7］。研究［8］证实，TSG-6主要是通过与HA、间α胰蛋白酶抑制物（IαI）、CD44等氨基葡聚糖类物质结合发挥上述生物学特性。本实验通过免疫组化染色及RT-PCR检测发现瘢痕组织炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α于TSG-6实验组表达均低于PBS对照组，结果提示TSG-6在瘢痕形成过程中亦具有明显抗炎作用。

病理性瘢痕常以成纤维细胞过度增殖、胶原等细胞外基质大量沉积为特征，其中成纤维细胞是参与组织修复的主要功能细胞和效应细胞，胶原等细胞外基质主要是由成纤维细胞合成和分泌的。因此，如何诱导瘢痕组织成纤维细胞凋亡可能是瘢痕治疗新的方式。Seidita et al［9］研究表明p53基因缺损的细胞中无TSG-6基因的表达，而在p53基因依赖的凋亡途径中TSG-6表达水平上调，且在p53介导的细胞周期G1期静止中，TSG-6直接受p53下游效应因子的调控。由此，可推测p53介导的细胞凋亡途径可能是TSG-6的另一生物学作用。同时，Choi et al［10］发现TSG-6可抑制核转录因子NF-κB的表达，而NF-κB在增生性瘢痕形成中具有抑制细胞凋亡的作用。这些研究提示TSG-6可能具有诱导细胞凋亡的作用。Qi et al［11］实验显示TSG-6的抗纤维化作用。为进一步探讨TSG-6对瘢痕组织成纤维细胞凋亡的影响，本研究以透射电镜观察及TUNEL法检测瘢痕组织成纤维细胞凋亡的变化，结果显示TSG-6实验组凋亡指数明显升高，但其机制尚不明确。

Tan et al［4］发现瘢痕疙瘩中TSG-6表达水平较无瘢痕修复皮肤明显减少，但较正常皮肤增多，且HA、IαI的表达及分布与TSG-6相一致。TSG-6序列含有高度保守的HA结合区，HA和TSG-6结合非常稳定［12］。已知HA可通过抑制前列腺素E2的水平、炎性细胞的趋化及氧自由基的产生等抗炎作用及抑制成纤维细胞分化等减少瘢痕形成，且在胎儿皮肤无瘢痕愈合过程中存在高浓度的HA［13］。课题组前期研究［14］表明TSG-6与病理性瘢痕形成具有相关性，本研究显示TSG-6实验组Ⅰ型、Ⅲ型胶原沉积明显减低，同时证实TSG-6对瘢痕形成具有明显抑制作用。

综上所述，通过早期创面TSG-6干预并予瘢痕组织局部注射TSG-6的方法对瘢痕形成及增生具有抑制作用，其抗瘢作用可能与抑制炎症反应及促进瘢痕组织细胞凋亡相关。

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The experimental study of anti-inflammatory cytokine TSG-6 inhibits hypertrophic scar formation in rabbit ears model

Wang Hui，Li Xiaojing，Chen Zhao
（Dept of Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the effect of tumor necrosis factor α stimulated gene-6（TSG-6）on hypertrophic scarring by using a rabbit ear model.MethodsTSG-6 and PBS were injected intradermally in the right and left ear wounds，respectively.Collagen I and III expression detected by immunohistochemistry and scar elevation index（SEI）was used to evaluate the extent of scarring.The expression of inflammatory factors interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）was detected by immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction.Transmission electron microscope（TEM）and TUNEL analyses were used to detect fibroblast apoptosis.ResultsCompared with control scars，TSG-6-treated wounds exhibited decreased inflammation significantly as evidenced by the lower levels of IL-1β，IL-6，TNF-α.The apoptosis rate was higher and the SEI and the synthesis of collagens I and III were significantly decreased in the TSG-6-treated scars（P＜0.05）.ConclusionImmediate topical injection of TSG-6 during the wound healing process can reduce the severity of hypertrophic scarring in a rabbit model.The anti-cicatrix effect of TSG-6 may result from controlling inflammation，inducing fibroblast apoptosis and promoting collagen degradation.

animal model；hypertrophic scar；rabbit；inflammation；TSG-6

R 619＋.6

1000－1492（2015）01－0045－05

2014－09－25接收

国家自然科学基金（编号：81272107）

安徽医科大学第一附属医院整形外科，合肥 230022

王 晖，男，硕士研究生；李小静，女，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：lixiaojing5＠163.com