三种滇龙胆叶片总RNA提取方法的比较①

张海晨 张晓东

(玉溪师范学院资源环境学院,云南玉溪653100)

三种滇龙胆叶片总RNA提取方法的比较①

张海晨 张晓东②

(玉溪师范学院资源环境学院,云南玉溪653100)

滇龙胆;总RNA;提取方法;异硫氰酸胍法;试剂盒法

分别使用传统异硫氰酸胍法和Takara公司的两种试剂盒来提取滇龙胆幼叶的总RNA,比较所提取RNA质量和纯度.结果表明,三种方法各有优缺点,但MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒提取的RNA质量好、纯度高、提取效率高,且无基因组污染,优于其他两种方法,而异硫氰酸胍法从经济的角度考虑则最为实惠.

滇龙胆是多年生草本植物,主要产自云南、四川、湖南、广西等地[1].滇龙胆具有悠久的药用历史,始载于《神农本草经》：“主骨间寒热,惊痫邪气,续绝伤,定五脏,杀蛊毒”.龙胆野生于海拔400～1 700 m的山坡草甸、山坡及灌木从中,喜阳光充足,较湿润的地方,喜凉爽气候,耐寒[2,3].文献检索结果表明,目前在分子方面对滇龙胆的研究很少.然而,要从分子生物学角度研究滇龙胆,首先要对滇龙胆的总RNA进行提取,获得纯度高、完整性好的RNA.本研究分别采用三种方法提取滇龙胆叶片中的总RNA,并通过琼脂糖凝胶电泳进行检测,比较三种方法的优缺点.

1 材料与方法

实验材料 滇龙胆无菌苗培养采用MS培养基培养,光周期为16 h光照、8 h黑暗.取滇龙胆幼叶,于天平中准确称量0.1 g进行总RNA的提取.实验所用研钵、研杵、离心管、枪头等均用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理.

实验方法 采用异硫氰酸胍法、试剂盒法1、试剂盒法2三种方法来提取滇龙胆叶片中的总RNA.

(1)异硫氰酸胍法提取总RNA.其提取步骤如下：①称取0.1 g叶片,迅速放入预先预冷的研钵中,加液氮研磨,直到研磨成粉末状.②加入0.9 m L异硫氰酸胍提取液(4M异硫氰酸胍,25m M柠檬酸三钠, 0.5%(w/v)十二烷基肌氨酸,2%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮),继续研磨成水状,转移至1.5 m L离心管,轻轻摇动离心管使混合均匀.③加入1/10体积的2 M醋酸钠(p H=4.2)、氯仿0.3 m L,合盖后剧烈震荡2 min,然后冰浴5 min.④4℃、12 000 rpm离心15 min后,将上清转移至新的离心管中;⑤加入等体积氯仿,合盖后剧烈震荡2 min,然后冰浴5 min.⑥4℃、12 000 rpm离心15 min后,将上清转移至新的离心管中;⑦加入等体积异丙醇,在-20℃沉淀RNA 30 min,4℃、12 000 rpm离心20 min.⑧RNA沉淀经75%乙醇清洗两次后,常温干燥5 min;⑨加入20μl DEPC处理水彻底溶解RNA.⑩采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA.

(2)试剂盒法1：RNAiso for Polysacchariderich Plant Tissue,提取步骤如下：①取0.1 g样品,使用液氮研磨至粉末状.②加入1 m L提取液,继续研磨至水状,转移至1.5 m L离心管中.③4℃、12 000 g离心5 min.④吸取上清液至新的1.5 m L离心管中.⑤向上述上清液中加入1/5体积的5 M NaCl和3/5体积的氯仿.盖紧离心管盖,用手剧烈振荡15 s,室温静置5 min.⑥4℃、12 000 g离心15 min.⑦吸取上清液转移至另一新的离心管中,加入1/2体积的异丙醇和1/2体积的高盐溶液,颠倒混匀后,室温静置10 min.⑧4℃、12 000 g离心15 min.⑨弃上清,加入75%乙醇1 m L清洗沉淀.⑩室温干燥沉淀5 min后,使用20μlRNase-free水溶解沉淀,再采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA.

(3)试剂盒法2：Takara MiniBEST Plant RNA Extraction Kit,实验步骤如下：①称量0.1 g样品,使用液氮研磨成粉末状,加入到450μl Buffer RL继续研磨成水状,然后转移至1.5 m L离心管中.②4℃、12 000 rpm离心5 min,将上清转移至新的1.5 m L离心管中,加入上清液1/2体积的无水乙醇,混匀.③立即将混合液转入到RNA Spin Column中,常温12 000 rpm离心1 min,弃滤液.④将500μl的Buffer RWA加入RNA Spin Column中,常温12 000 rpm离心30s,弃滤液.⑤将600μl的Buffer RWB加入RNA Spin Column中,常温12 000 rpm离心30s,弃滤液.⑥向RNA Spin Column膜中央加入50μl DNase I反应液,室温静置15 min.⑦向RNA Spin Column膜中央加入350μl的Buffer RWB,常温12 000 rpm离心30s,弃滤液.⑧重复步骤⑤,将RNA Spin Column重新安置于2 m L Collection Tube上,常温12 000 rpm离心2 min.⑨将RNA Spin Column安置于1.5 m L离心管上,在RNA Spin Column膜中央处加入30μl的0.1%DEPC处理水,室温静置5 min.⑩常温12 000 rpm离心2 min洗脱总RNA,采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA.

2 结果和分析

使用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果如附图.由附图可知,三种方法提取植物的总RNA在质量方面都不错,条带清晰,28S的亮度是18S的亮度的两倍以上,证明所提取的RNA完整度较好.

附图 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果

但是,三种方法都有各自的优缺点.(1)使用异硫氰酸胍法提取总RNA时,其步骤比较繁琐,稍有操作不当就可能前功尽弃,粗提的总RNA中含有较多的基因组DNA(附图A),需要进一步除去基因组的步骤,耗时费力.但异硫氰酸胍法的优点是成本低、提取量可大可小.(2)RNAiso for Polysaccharide-richPlant Tissue试剂中含有大量的还原剂,可避免多酚类物质在提取过程中被氧化而导致RNA的降解;该试剂不含有苯酚等挥发性有毒成份,对实验人员毒害性较小.但该试剂盒提取的总RNA中也含有基因组(附图B),也要进行除基因组的步骤,步骤繁琐,但其优点是提取出的总RNA的量大.(3)MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒具有高效、快速、方便之特点,操作时间也短;提取过程中无需苯酚氯仿抽提等步骤.利用该试剂盒提取的总RNA纯度高,基本不含有蛋白质及基因组DNA的污染.但其缺点是价格较高.MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒法的提取结果见(附图C).

3 讨 论

目前,关于RNA的提取方法有很多种,但每种方法都有其优缺点.但总体看,本文所采用的三种方法提取出的总RNA的质量和纯度均能满足一般的分子操作的要求.

在分子实验中,获得纯度高、完整性好的RNA是实验成功的前提.提取得到的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、m RNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、Real Time RTPCR、构建c DNA文库等各种分子生物学实验.在RNA提取和检测过程中,外源性RNase主要来自所用的器皿、缓冲液和移液器等,因此在实验过程中要注意彻底去除外源RNase的污染.

滇龙胆是云南的地道药材,但由于其市场需求不断增大且其生长缓慢,造成人为滥采滥挖,进而导致野生滇龙胆数量日渐减少,所以保护野生龙胆刻不容缓[4].

[1]杨雁,邵爱娟,金航,等.云贵高原滇龙胆不同居群形态特征变异研究[J].中草药,2012,43(8)：1604-1610.

[2]唐荣平,苏汉林,王建光,等.滇龙胆草资源调查及繁殖特性研究[J].山地农业生物学报,2012(5)：460-463.

[3]张金渝,沈涛,杨维泽,等.云南道地药材滇龙胆资源调查与评价[J].植物遗传资源学报,2012(5)：890-895.

[4]唐荣平,苏汉林,阳小勇,等.滇西南药用植物滇龙胆草的致危因素和保护策略探讨[J].山地农业生物学报,2013 (5)：445-447,470.

Comparison of Three Methods for Extraction of Total RNA in Gentianarigescens Leaf

ZHANG Haichen ZHANG Xiaodong
(College of Resources and Environment,Yuxi Normal University,Yuxi,Yunnan 653100,China)

Gentiana rigescens;total RNA;extraction;guanidine thiocyanate;method of kits

With young leaves of Gentianarigescens as experiment material,its total RNA was extracted by the traditional method of guanidine thiocyanate and two kits of TaKaRa Company.The quality and purity of the total RNA were compared. Results showed that the method of guanidine thiocyanate was the most economical and the Mini BEST Plant RNA Extraction kit was superior to the other two methods because its resulting RNA is of high quality and purity,and it is highly efficient and without genomic DNA contamination.

张海晨,研究方向：植物分子生物学.

O157.1

A

1009-9506(2015)08-0026-03

2015年2月19日

云南省大学生创新项目,编号：201411390001.

②通信作者：张晓东,博士,研究方向：植物代谢基因工程.Email：zxd95@126.com.