阳离子-氯离子联合转运蛋白抑制剂对氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影响及对其海马凋亡的影响

唐俊霞　冯念海　陶　琦　(淄博市中心医院麻醉科，山东　淄博　255036)



阳离子-氯离子联合转运蛋白抑制剂对氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影响及对其海马凋亡的影响

唐俊霞冯念海陶琦(淄博市中心医院麻醉科，山东淄博255036)

〔摘要〕目的探讨阳离子-氯离子联合转运蛋白(CCC)抑制剂对氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影响及对其海马凋亡的影响。方法选取幼年SPF级昆明种小鼠60只，随机分为两组，其中对照组30只，实验组30只，予100 mg/kg氯胺酮腹腔注射，待小鼠翻正反射消失，反复腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，维持麻醉时间为6 h后，予实验组小鼠布美他尼溶液100 μg/kg腹腔注射，同时予对照组等量的生理盐水腹腔注射。对比两组小鼠的苏醒时间、海马区细胞凋亡密度以及海马区NMDA-2B受体表达情况。结果实验组小鼠的苏醒时间明显短于对照组(P＜0. 05);高倍镜下观察显示体积较正常细胞小者为凋亡细胞，其细胞核内含紫蓝色或黑色的凋亡小体，实验组凋亡细胞明显少于对照组;实验组凋亡细胞密度与对照组比较明显较低(P＜0. 05);免疫组化法检测显示NMDA-2B受体阳性细胞染色呈棕黄色，多位于CA3区海马组织，分布均匀，与对照组比较，实验组的阳性细胞数目明显较少; Western印迹法测定结果显示，实验组小鼠的NMDA-2B受体灰度值明显低于对照组(P＜0. 05)。结论CCC抑制剂对氯胺酮麻醉模型小鼠具有催醒作用，能够明显抑制其海马细胞凋亡，对临床具有指导意义，值得临床推广。

〔关键词〕阳离子-氯离子联合转运蛋白抑制剂;氯胺酮麻醉;催醒;海马凋亡

氯胺酮广泛应用于小儿麻醉〔1〕。但有研究发现〔2〕，氯胺酮在麻醉过程中需要反复给药，容易出现麻醉过深，苏醒时间较长的现象，导致苏醒延迟。另有研究显示〔3〕，应用氯胺酮能够使幼鼠的神经细胞凋亡，影响幼鼠成年后的学习、认知以及记忆能力。阳离子-氯离子联合转运蛋白(CCC)抑制剂能够控制离子通道，影响细胞内外钠离子、钾离子、钙离子、氯离子的转运及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的表达〔4，5〕，能够减少氯胺酮的负面作用，缩短苏醒时间，防止神经细胞损伤。本文旨在探究CCC抑制剂对氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒影响及对其海马凋亡的影响。

1　对象与方法

1. 1实验动物与分组选取幼年(出生7 d)的SPF级昆明种小鼠60只(由辽宁中医药大学动物实验中心提供)，雌性30只，雄性30只，体重(18±3)g。将大鼠随机分为两组，实验组30只，对照组30只。将小鼠置入安静、温暖、湿度适中、光照充足的环境中，以标准饲料喂养，让其自由进食水。

1. 2主要试剂和仪器盐酸氯胺酮注射液(北京紫竹药业有限公司);布美他尼注射液(辽宁玉皇药业有限公司);小鼠NMDA-2B抗体试剂盒(上海丰寿实业有限公司);磷酸盐缓冲液(PBS)(BOSTER公司); Western封闭液、专用一抗二抗稀释液、羊抗兔二抗(南京生兴生物科技有限公司);蛋白电泳仪、离心机(美国贝克曼库尔特公司); DW-86W100超低温冰箱(青岛海尔); SpectraMax M5酶标仪(美国Molecular Devices)。

1. 3造模方法正常适应性饲养两组小鼠3 d，全部小鼠予100 mg/kg氯胺酮腹腔注射，待小鼠连续仰卧3次且在5 s内不能站立时即表示翻正反射消失〔5〕，反复腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，维持麻醉时间为6 h; 6 h后给予实验组小鼠布美他尼溶液100 μg/kg腹腔注射，予对照组等量的生理盐水腹腔注射。

1. 4观察指标及检测方法

1. 4. 1苏醒时间小鼠翻正反射恢复即认为其苏醒，也就是连续仰卧3次之后可以恢复直立〔6〕，记录两组小鼠自翻正反射消失6 h后至翻正反射恢复的时间。

1. 4. 2小鼠海马区细胞凋亡情况检测小鼠翻正反射恢复后，继续常规饲养24 h。将小鼠麻醉后处死，断头，取海马组织，置于液氮中保存。取出部分海马组织，利用4%多聚甲醛固定，采用梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，切成4 μm切片备用。

将切片脱蜡→室温下，置于0. 1%TritonX100液中→10 min后，流水冲洗→PBS冲洗3次，1 min/次→37℃下，加入标记物→1 h后，PBS冲洗3次，1 min/次→37℃下，加入转换液→30 min后，PBS冲洗3次，1 min/次→加入BCIP- NBT显色→10 min后，流水冲洗→PBS冲洗3次，1 min/次→封片。

判定标准〔7〕:凋亡小体多位于细胞核内，染色呈紫蓝或黑，颜色越深凋亡细胞的密度越大。在高倍显微镜下观察凋亡细胞数，采用医学图像管理系统计算凋亡细胞密度值。

1. 4. 3免疫组化法〔8〕检测小鼠海马组织NMDA-2B受体表达水平将备用切片脱蜡，利用梯度浓度酒精水化;利用3%过氧化氢水溶液使过氧化物酶变性;切片置入高温柠檬酸溶液，进行抗原修复;冷却后用PBS洗涤;室温下，加5%胎牛血清(BSA)封闭;去除血清，加入稀释后NMDA-2B抗体，37℃孵育1 h; PBS清洗5次，滴加二抗工作液，37℃孵育; 30 min后，PBS清洗5次;加入二氨基联苯胺(DAB)液显色5 min; PBS清洗5次后，采用苏木素复染;清洗后常规脱水、透明、封片，利用高倍显微镜观察，染色呈棕黄色者为阳性细胞。

1. 4. 4 Western印迹法测定小鼠海马组织NMDA-2B受体表达水平取出保存于液氮中的海马组织，剪碎，利用匀浆器研磨光滑; 12 000 r/min离心20 min;取上清，加入上样缓冲液;高温加热5 min，样本加入上样孔中;电泳槽电压80 V，进行电泳;分离胶染色后，电压改为120 V，电泳至染色区域距玻璃板1 cm;将凝胶染色转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;室温下，将PVDF膜置入含有Western印迹抗体的孵育盒中;封闭2 h后，用Tris盐酸缓冲液(TBST)冲洗5 min，3次; PVDF膜置入稀释的兔抗NMDA-2B溶液中，4℃摇床过夜;将PVDF膜置入稀释后羊抗兔二抗溶液中2 h;清洗后，利用红外激光成像系统扫描，观察蛋白表达的灰度值〔7〕。

1. 5统计学方法应用SPSS19. 0软件进行t检验、χ2检验。

2　结果

2. 1两组小鼠苏醒时间比较实验组小鼠的苏醒时间〔(3.17±2.36)min〕明显短于对照组〔(6.35±2.74)min〕(P＜0.05)。

2. 2两组小鼠海马区细胞凋亡情况比较高倍镜下观察显示体积较正常细胞小者为凋亡细胞，其细胞核内含紫蓝色或黑色的凋亡小体，实验组凋亡细胞明显少于对照组;实验组凋亡细胞密度(0. 98±0. 62)明显低于对照组(3. 73±2. 11)(P＜0. 05)。见图1。

2. 3免疫组化法检测两组小鼠海马组织NMDA-2B受体表达比较NMDA-2B受体阳性细胞染色呈棕黄色，多位于CA3区海马组织，分布均匀，与对照组比较，实验组的阳性细胞数目明显较少，见图2。

2. 4 Western印迹法测定两组小鼠海马组织NMDA-2B受体表达比较实验组小鼠的NMDA-2B受体灰度值(0. 81±0. 02)明显低于对照组(1. 13±0. 04)(P＜0. 05)。见表1。

图1　两组小鼠海马组织细胞凋亡情况(×400)

图2　两组NMDA-2B受体表达情况(×400)

表1　 Western印迹法测定小鼠海马组织NMDA-2B受体蛋白比较(x±s)

3　讨论

氯胺酮是一种NMDA受体拮抗剂，具有起效快、镇痛效果好、对呼吸系统影响小等特点〔9〕，广泛应用于小儿麻醉。虽然氯胺酮安全性较高，但近年来有研究发现，由于麻醉作用表浅，需反复用药，容易导致患者苏醒的延迟〔10〕。另有研究认为，小儿脑神经尚未发育完全，生长过程中极易受到干扰〔11〕，氯胺酮对神经功能的抑制作用亦能影响神经细胞生长发育，而且，有实验研究表明，氯胺酮能够诱导幼鼠神经细胞的凋亡〔12〕，影响记忆、学习等功能。

本研究结果提示CCC抑制剂可以明显抑制小鼠海马组织细胞凋亡，防止神经损伤;另外CCC抑制剂可能通过减少NMDA-2B受体的表达，来抑制神经细胞凋亡。资料显示，CCC抑制剂可以影响细胞膜氯钙通道的开放，促进钙离子内流，增加细胞内钙离子浓度〔13〕，激活丝裂素活化蛋白激酶，消除氯胺酮对NMDA的拮抗作用〔14〕，减少细胞凋亡。本研究提示CCC抑制剂对氯胺酮麻醉小鼠具有催醒作用，可防止苏醒延迟。

4参考文献

1沈通桃，钱燕宁.小剂量氯胺酮的临床应用〔J〕．国外医学·麻醉学与复苏分册，2003; 24(6): 343-7.

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3黄河，杨天德，杨辉，等.氯胺酮对体外培养大鼠神经干细胞增殖与凋亡的影响〔J〕．中华麻醉学杂志，2006; 26(8): 752-5.

4何雁冰.阳离子——氯离子联合转运蛋白抑制剂在大鼠术后疼痛模型中的镇痛作用研究〔D〕．广州:南方医科大学硕士论文，2014.

5黄俊杰.鞘内注射布美他尼对大鼠急性疼痛行为及钠钾氯联合转运蛋白1表达的影响〔D〕．广州:广州医学院硕士论文，2012.

6张法强，王宏刚，纪振华，等.不同催醒药对氯胺酮麻醉小鼠的催醒效果〔J〕．徐州医学院学报，2008; 28(5): 297-9.

7陈琳，张彩丽，鞠艳敏，等.育亨宾、纳洛酮及两药合用对氯胺酮麻醉模型小鼠的催醒试验〔J〕．中国组织工程研究，2012; 16(28): 5181-4.

8冯作炫.反复氯胺酮给药对老年小鼠认知记忆和海马区神经细胞凋亡的影响〔D〕．福州:福建医科大学硕士论文，2008.

9张祯浪.亚麻醉剂量氯胺酮-芬太尼辅助小儿区域麻醉临床效果观察〔J〕．山东医药，2009; 49(47): 46-7.

10杨长青.学龄期患儿氯胺酮麻醉术后躁动的观察及护理〔J〕．中华护理杂志，2004; 39(5): 350-1.

11郭东勇，谭涛，田心，等.新生大鼠氯胺酮麻醉对成年后认知功能的影响〔J〕．中华麻醉学杂志，2012; 32(4): 420-2.

12陈晨，田乃元，吴旭，等.氯胺酮导致小鼠认知功能障碍及其与NMDA表达的研究进展〔J〕．实用药物与临床，2014; 17(5): 607-10，611.

13刘洁，阮林，伍志坤，等.布美他尼对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑水肿及海马CA1区NMDA受体1型表达的影响〔J〕．广东医学，2014; 35(19): 2983-5.

14 Wang DD，Kriegstein AR. GABA regulates excitatory synapse formation in the neocortex via NMDA receptor activation.〔J〕．J Neurosci，2008; 28(21): 5547-58.

〔2015-02-11修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5740-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 025

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R614

第一作者:唐俊霞(1968-)，女，副主任医师，主要从事老年麻醉研究。