共表达pcIL-18/MAGE-1DNA疫苗对JEG-3细胞HLA-G基因表达的影响

齐亚灵　赵文杰　王伟群杨广民时　阳方艳秋钟南田　洪　灯　张彦慧　周　雯　符皎荣(海南医学院，海南　海口　5799)



共表达pcIL-18/MAGE-1DNA疫苗对JEG-3细胞HLA-G基因表达的影响

齐亚灵赵文杰王伟群1杨广民2时阳2方艳秋2钟南田洪灯张彦慧周雯符皎荣
(海南医学院，海南海口571199)

〔摘要〕目的观察共表达基因疫苗pcIL-18/MAGE-1对绒癌JEG-3细胞株HLA-G基因表达的影响，探究pcIL-18/MAGE-1抗肿瘤作用机制。方法应用构建的共表达pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗免疫小鼠，同时设阴性对照组和空白对照组，免疫后分别收集脾细胞，作用于靶细胞JEG-3，应用FCM检测小鼠T细胞亚群情况及NK细胞活性，MTT法检测肿瘤特异性CTL对靶细胞的杀伤率，RT-PCR法检测HLA-G基因表达情况。结果免疫组HLA-G基因表达降低，且对JEG-3细胞杀伤活性增加，与对照组比较，差异显著(P＜0. 05)。免疫组NK细胞活性及CD4+/CD8+、CD8+、CD4+值均高于对照组(P＜0. 05)。结论共表达基因疫苗pcIL-18/MAGE-1通过降低HLA-G基因的表达，进而增加NK细胞活性以及诱导肿瘤特异性CTL直接杀伤肿瘤细胞，发挥抗肿瘤作用。

〔关键词〕MAGE-1; IL-18;绒癌; JEG-3细胞株;人类白细胞抗原-G

1佳木斯大学2吉林省人民医院肿瘤生物治疗中心

第一作者:齐亚灵(1967-)，女，教授，医学博士，博士生导师，主要从事肿瘤基因诊断与生物治疗研究。

pcIL-18-MAGE-1共表达基因疫苗接种免疫后小鼠脾细胞作为效应细胞，作用于肝癌SMMC-7721和Hepal-6细胞株，证实该疫苗通过同时激活CD4+T细胞及CD8+T细胞、增加NK细胞活性及诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)直接杀伤肿瘤细胞〔1〕;体内试验证实pcIL-18-MAGE共表达基因疫苗对荷瘤鼠具有一定抗肿瘤作用〔2〕。本文观察pcIL-18-MAGE-1共表达基因疫苗对JEG-3细胞人类白细胞抗原(HLA)-G基因表达的影响，进一步探究pcIL-18/MAGE-1抗肿瘤作用机制。

1　材料与方法

1. 1实验动物、细胞株、质粒清洁级雌性C57BL/6J小鼠(中国医学科学院实验动物研究所)，体重(20±2)g，自由食水，无菌动物室饲养。质粒pcIL-18-pcMAGE-1、pcDNA3、绒癌JEG-3细胞株(吉林省人民医院肿瘤生物治疗中心提供)。

1. 2主要试剂胎牛血清、IMDM细胞培养液、淋巴细胞分离液(PAA)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、3%氢氧化铝(武汉博士德公司)。异硫氰酸荧光素(FITC)与PE标记的羊抗鼠CD4+、CD8+单抗、FITC标记的羊抗鼠IgG单抗、HLA-G单抗(美国Immunotech公司)，Trizol试剂盒、RT-PCR试剂盒(武汉阳达生物科技有限公司)，引物(上海生工生物公司)。

1. 3免疫方法及实验分组小鼠大腿内侧肌群肌肉注射:疫苗免疫组〔100 μg(0. 4 ml 3%氢氧化铝胶)pcIL-18-pcMAGE-1〕、阴性对照组(等量pcDNA3)及空白对照组(等量0. 9%NaCl无菌水溶液)。1次/10 d，3次，末次注射7 d后，断头处死小鼠，将取出的脾脏浸入细胞培养液中研磨，200目滤网过滤，收集脾细胞备用。

1. 4流式细胞仪(FCM)检测NK细胞活性及T细胞亚群每组分别取1×106个小鼠脾细胞，0. 1 mol/L PBS×2次，加入单抗10 μl，室温避光，20 min。PBS×2次，加0. 5 ml PBS混匀，10 min后，上机检测。

1. 5 MTT法检测小鼠脾细胞对JEG-3细胞杀伤率将JEG-3细胞加入96孔板中，每孔4×104个细胞，贴壁后，分别加入空白对照组、阴性对照组及疫苗免疫组的4×106个效应脾细胞，每组设3个复孔。37℃、5%CO2培养箱孵育12 h;弃掉培养基及悬浮细胞，每孔加50 μl 0. 5 mg/ml MTT，37℃、5%CO2培养箱孵育4 h，弃上清，加100 μl DMSO，震荡10 min，酶标仪在570 nm处测吸光度值(OD值)。杀伤率(%)= 1－OD(效应细胞+靶细胞)－OD效应细胞×100%。OD靶细胞

1. 6 RT-PCR技术检测HLA-G基因表达情况将JEG-3细胞加入96孔板中(4×104个细胞/每孔)，贴壁后，将收集的阴性对照组、空白对照组及疫苗免疫组效应脾细胞(4×106个细胞/每孔)加入，同时设不加脾细胞的常规培养的JEG-3细胞为阳性对照组。37℃、5%CO2培养箱孵育24 h;弃掉培养基，分离收集JEG-3细胞，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA、RT-PCR试剂盒进行扩增，琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶分析系统对扩增条带进行密度分析，用平均灰度值代表相应基因的表达量。参照文献〔3〕设计引物序列及反应体系，β-actin产物为619 bp，HLA-G产物为770 bp。mRNA的相对表达量=HLA-G平均灰度值/βactin平均灰度值。

1. 7统计学方法使用SPSS19. 0软件进行t检验。

2　结果

2. 1 FCM检测结果与阴性对照组和空白对照组比较，疫苗免疫组脾细胞中CD4+/CD8+比值及CD8+、CD4+细胞比例及NK细胞活性显著增高(P＜0. 01，P＜0. 05)。阴性对照组与空白对照组差异不显著(P＞0. 05)。见表1。

表1　各组细胞亚群和NK细胞活性比较(n=10，x ±s)

2. 2 MTT法检测结果疫苗免疫组杀伤率(22. 1%±2. 3%)最高，与阴性对照组(14. 1%±1. 2%)和空白对照组(13. 1%± 1. 3%)差异显著(P＜0. 05)。

2. 3 RT-PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳结果显示，各组JEG-3细胞中均有HLA-G基因表达，阳性对照组、空白对照组、阴性对照组HLA-G基因表达无明显差异，疫苗免疫组HLA-G基因表达水平明显降低(P＜0. 05)，见图1。

3　讨论

机体内具有免疫监视作用的主要效应细胞有CTL细胞和

图1　各组HLA-G mRNA表达RT-PCR结果

M. Marker; 1.空白对照组; 2.阳性对照组; 3.阴性对照组; 4.疫苗免疫组NK细胞，CTL细胞主要通过识别肿瘤细胞表面的MHC-I类分子，杀伤肿瘤细胞;对于不表达MHC-I类分子的肿瘤细胞，NK细胞直接杀伤。为了观察共表达pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗对JEG-3细胞是否具有杀伤作用，我们应用构建的共表达pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗免疫小鼠，同时设阴性对照组和空白对照组，免疫后分别收集脾细胞，作用于绒癌JEG-3细胞，应用FCM检测小鼠T细胞亚群情况及NK细胞活性，MTT法检测肿瘤特异性CTL对靶细胞的杀伤率，结果表明，构建的pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗通过同时激活CD4+T细胞及CD8+T细胞、增加NK细胞活性以及诱导肿瘤特异性CTL直接抑制绒癌JEG-3细胞的增殖。

肿瘤细胞具有免疫逃逸功能，通过MHC-I类分子的变构和丢失或高表达HLA-G分子逃避CTL和NK细胞的杀伤作用。非经典的HLA-I类抗原——人类白细胞抗原-G(HLA-G)，是机体内重要的免疫耐受分子，HLA-G分子通过与免疫细胞上的抑制性受体:免疫球蛋白样转录物2、免疫球蛋白样转录物4及杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIR相互作用直接抑制CTL和NK细胞介导的细胞杀伤活性〔4〕;通过诱导产生多种调节性细胞及细胞因子等间接发挥免疫抑制效应〔5〕，进而导致肿瘤细胞发生免疫逃逸。HLA-G在人类乳腺癌、结肠癌、肝癌、肾癌、肺癌等组织中可表达HLA-G，并具有肿瘤特异性〔6，7〕，HLA-G在绒癌JEG-3细胞株中呈现高表达〔8〕。本文结果表明疫苗免疫后的效应细胞可以降低JEG-3细胞HLA-G基因表达。推测，共表达pcIL-18/MAGE-1 DNA疫苗对JEG-3细胞增殖抑制作用，是通过降低HLA-G基因表达，进而增加NK细胞活性及诱导肿瘤特异性CTL途径实现的，具体信号转导途径有待进一步研究。

4参考文献

1齐亚灵，孟德欣，杨广民，等. pcIL-18-MAGE-1共表达基因疫苗对肝癌细胞株SMMC-7721、Hepal-6增殖影响〔J〕．中国老年学杂志，2014; 34(21): 6093-4.

2齐亚灵，王伟群，杨广民，等. pcIL-18-MAGE-1基因疫苗免疫荷瘤小鼠抑瘤作用〔J〕．中国老年学杂志，2014; 34(20): 5787-8.

3 Hurks HM，Valter MM，Wilson L，et al．Uveal melanoma: no expression of HLA-G〔J〕．Invest Ophthalmol Vis Sci，2001; 42(13): 3081-4.

4李营营，许惠惠，颜卫华．HLA-G与NK细胞〔J〕．现代免疫学，2015; 35(2): 160-2，159.

5 Naji A，Menier C，Morandi F，et al．Binding of HLA-G to ITIM-bearing Iglike transcript 2 receptor suppresses B cell responses〔J〕．J Immunol，2014; 192(4): 1536-46.

6 Hansel DE，Rahman A，Wilentz RE，et al．HLA-G upregulation in pre-malignant and malignant lesions of the gastrointestinal tract〔J〕．Int J Gastrointest Cancer，2005; 35(1): 15-23.

7宋新宇，陈世雄，曾凡军，等．非小细胞肺癌中HLA-G的表达及其与IL-10的相关性〔J〕．中国老年学杂志，2011; 31(10): 1746-7.

8王建英，李勇，程建新，等.天花粉蛋白对绒癌细胞JEG-3体外增值和HLA-G、HLA-E表达的影响〔J〕．中国老年学杂志，2008; 28(3): 247-9.

〔2014-10-19修回〕

(编辑苑云杰)

通讯作者:方艳秋(1968-)，女，主任医师，医学博士，主要从事肿瘤生物治疗研究。

基金项目:海南省自然科学基金(No．310051)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5723-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 018

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R735. 7