活性维生素D对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的抑制效果及其可能机制

2015-12-15王世英陈宝平河南大学淮河医院河南开封475000

中国老年学杂志 2015年20期

王世英　时　军　陈宝平　(河南大学淮河医院，河南　开封　475000)

王世英时军陈宝平(河南大学淮河医院，河南开封475000)

〔摘要〕目的探讨活性维生素D对糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞损伤的抑制效果及其可能机制。方法将48只Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组(NC组)、正常大鼠给予活性维生素D干预组(VD组)、DN模型组(DN组)、给予活性维生素D干预的DN模型组(DN+VD组)，每组10只。定期收集血、尿标本，18 w末处死，检测尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、尿蛋白水平;分别采用过碘酸雪夫(PAS)、Mssson染色观察肾组织病理改变，电镜下观察足细胞改变。免疫组化检测肾组织VDR和相关蛋白表达情况。Western印迹分析相关蛋白表达与PI3K/p-Akt信号通路的关系。结果造模后6～18 w，与NC组、VD组相比，DN组尿蛋白量明显上升(P＜0. 05)，在给予VD干预后18 w结束时约降低37%。造模18 w后，DN组肾质量体质量比明显高于NC组和VD组(P＜0. 05)，给予VD干预后明显下降。DN组、DN+VD组血BUN水平明显高于NC组和VD组(P＜0. 05)。NC组和VD组高表达Podocin和Nephrin，DN组大鼠以上两种蛋白表达明显减少; NC组大鼠低表达Desmin，DN组大鼠表达明显增加。给予VD干预后Podocin和Nephrin表达均明显高于DN组，但仍明显低于NC组和VD组; Desmin表达明显低于DN组。DN组大鼠VDR表达水平明显低于NC组和VD组，给予VD干预后表达水平明显上升。DN组大鼠肾组织PI3K-p85表白水平明显低于NC组和VD组，给予VD干预后表达水平明显上升。四组间总Akt水平无明显差异，但DN组p-Akt水平表达明显降低，经VD干预后明显上升。相关性分析显示，Nephrin与VDR、PI3K-p85、p-Akt之间均呈明显的正相关。结论活性维生素D可有效抑制链脲佐菌素(STZ)诱导的DN大鼠足细胞损伤，其机制可能与影响PI3K/p-Akt信号通路有关。

〔关键词〕糖尿病肾病;活性维生素D;足细胞;机制

糖尿病肾病(DN)病情发展中足细胞损伤是一个重要环节，但其机制目前仍未完全明确。足细胞中存在特殊的足突结构，且足突彼此相连也依赖于裂孔膈膜蛋白。研究显示足细胞裂孔膈膜蛋白Podocin、Nephrin等表达异常为足细胞早期损伤的一个特异性标志，同时Nephrin还是重要的信号蛋白〔1〕。有研究显示，在某些疾病状态下，通过稳定PI3K/p-Akt信号通路能够有效缓解足细胞受损，降低蛋白尿发生率〔2〕。本文旨在研究活性维生素D对DN大鼠足细胞损伤的抑制作用，并探讨活性维生素D是否通过稳定PI3K/p-Akt信号通路来抑制足细胞损伤。

1　材料与方法

1. 1材料健康清洁级Wistar雄性大鼠40只，质量170～190 g，购于上海斯莱克实验动物技术有限责任公司，动物合格证号: SCXK(沪): 2007-0005。活性维生素D3(上海罗氏制药有限公司，国药准字J20100056)。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，血糖检测仪(德国罗氏)，兔抗大鼠VDR及Podocin多克隆抗体(美国Bioss公司)，兔抗大鼠Nephrin、Desmin、PI3K-p85、Akt、p-Akt多克隆抗体(美国Immunoway公司)，免疫组化试剂盒(上海金标生物科技有限公司)。

1. 2研究方法

1. 2. 1模型建立与分组大鼠适应性喂养1 w后，禁食自由饮食12 h，随机分为正常对照组(NC组)、正常大鼠给予活性维生素D干预组(VD组)、DN模型组(DN组)、给予活性维生素D干预的DN模型组(DN+VD组)，每组10只。DN组大鼠给予60 mg/kg STZ一次性腹腔注射建模，3 d后检测血糖水平＞16. 7 mmol/L说明造模成功; NC组给予等量生理盐水腹腔注射。造模成功后第2天，VD组给予花生油为溶剂的骨化三醇溶液0. 1 μg·kd－1·d－1灌胃，其余两组给予等量花生油灌胃。

1. 2. 2样本收集与检测模型建立后每2 w检测1次大鼠体质量和血糖水平，每3 w收集24 h尿液。在第18周结束时处死大鼠，留取血液样本和肾组织标本。采用全自动生化分析仪检测血钙(Ca)、血磷(P)、血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)水平，采用马斯亮蓝法测定24 h尿蛋白量水平。

1. 2. 3肾脏组织病理学检查肾脏组织采用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后进行切片和过碘酸雪夫(PAS)染色、Mssson染色，在光学显微镜下观察病理学改变。采用Image-Pro6. 0软件计算肾小球面积和系膜基质增生面积。每张切片均随机取30个联系不重复的肾小球，进行肾脏损伤评分。经3. 0%戊二醛固定、制片，在电镜下观察肾小球足突和基底膜的变化。

1. 2. 4免疫组织化学将石蜡切片脱蜡水化，微波对抗原进行修复，免疫组化染色(SP)法使用免疫组化试剂盒检测VDR、Podocin、Nephrin、Desmin的表达。操作严格按照说明书进行。每张切片均随机取30个不同的肾小球视野，进行半定量分析:无色(－)、淡黄色(+)、棕黄色()、棕褐色()。依据免疫组化反应评价标准进行评分。

1. 2. 5 Western印迹分析取适量液氮冻存的肾皮质，加入含磷酸酶抑制剂和蛋白酶的裂解液，超声破碎后在4℃条件下2 000 r/min离心30 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。取等量的组织蛋白，90℃温度下变性5 min，10%的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳后按湿转法将产物转印到聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，使用含10%的脱脂牛奶室温条件下封闭60 min，之后采用0. 5%Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，分别于本次研究中选用的抗体在4℃条件下孵育过夜，洗膜后加入标记的二抗在室温条件下孵育60 min，洗膜后采用增加化学发光法(ECL)处理后用凝胶定量分析系统测量蛋白条带吸光度。以β-actin为内参，检测蛋白的相对表达水平。

1. 3统计学方法应用SPSS18. 0软件进行方差分析和Pearson分析。

2　结果

2. 1大鼠血、尿指标变化情况造模后6～18 w，与NC组、VD组相比，DN组尿蛋白量明显上升(P＜0. 05)，在给予VD干预后明显下降，18 w结束时约降低37%，但仍明显高于NC组(P＜0. 05)。造模18 w后，DN组肾质量体质量比明显高于NC组和VD组(P＜0. 05)，在给予VD干预后明显下降，但仍高于NC组和VD组。NC组与VD组之间血BUN水平差异无统计学意义(P＞0. 05); DN组、DN+VD组血BUN水平明显高于NC组和VD组(P＜0. 05)。血钙、血磷、血Scr等指标四组间差异无统计学意义(P＞0. 05)。

2. 2大鼠肾组织病理学改变PAS染色显示，DN组大鼠肾小球肥大伴系膜基质明显增生，在给予VD干预后病变情况明显减轻。Masson染色显示，四组大鼠肾组织慢性化损伤指标之间无明显差异。电镜观察显示，DN组大鼠肾小球足突出现融合，基底膜厚度增加，DN+VD组以上病变明显减轻。见图1。

图1　四组大鼠肾组织病理学改变

PAS、Masson染色(×400); EM(×10 000)

2. 3大鼠肾组织足细胞Podocin、Nephrin、Desmin表达情况SP法显示，NC组和VD组高表达Podocin和Nephrin，DN组大鼠以上两种蛋白表达明显减少; NC组大鼠低表达Desmin，DN组大鼠表达明显增加。免疫组化半定量和Western印迹分析显示，给予VD干预后Podocin和Nephrin表达均明显高于DN组，但仍明显低于NC组和VD组; Desmin表达明显低于DN组。见图2。

图2　四组大鼠肾组织足细胞Podocin、Nephrin、Desmin表达

2. 4大鼠肾组织中VDR表达情况NC组大鼠肾组织中VDR主要在足细胞表达，DN组大鼠VDR表达水平明显低于NC组和VD组，给予VD干预后表达水平明显上升。见图3。

图3　四组大鼠肾组织中VDR表达

2. 5维生素D对大鼠肾组织PI3K/p-Akt信号通路影响DN组大鼠肾组织PI3K-p85表白水平明显低于NC组和VD组，给予VD干预后表达水平明显上升。四组间总Akt水平无明显差异，但DN组p-Akt水平表达明显降低，经VD干预后明显上升。见图4。

图4　四组大鼠肾组织PI3K-p85、Akt、p-Akt表达

2. 6 Nephrin与VDR、PI3K、p-Akt相关性分析Pearson分析显示，Nephrin与VDR、PI3K-p85、p-Akt之间均呈明显的正相关(r=0. 787、0. 747、0. 866，P=0. 029、0. 031、0. 016)。

3　讨论

目前研究显示，活性维生素D除具有调节体内钙、磷离子和骨代谢之外，还对内分泌、神经、生殖、免疫等多方面发挥着重要的生理功能，其可有效降低慢性肾脏疾病患者的尿蛋白水平〔3〕。在2型糖尿病患者中活性维生素D缺乏为治疗预后的独立危险因素，相关动物研究也显示，维生素D干预后可明显降低尿蛋白水平，减少足细胞损失〔4〕。但目前为止维生素D对肾脏的上述保护作用的机制仍未明确。

有研究显示，肾小球足细胞受损为DN早期主要的分子病理学特征，其中足细胞损失相关蛋白Podocin、Nephrin的非正常表达为特征性标志〔5〕。本研究说明DN大鼠存在明显的足细胞损伤。另外维生素D可有效抑制DN大鼠的足细胞损伤，但相关作用机制仍需要进一步研究。本次研究中活性维生素D未对DN大鼠血Scr、BUN产生明显影响，其可能与Scr、BUN的改变受多因素影响有关。

Nephrin为一种有信号蛋白和结构蛋白功能的肾组织足细胞特异分子，其异常表达会在一些病理状态下随着足细胞表型和蛋白尿的改变而变化〔6〕。本研究进一步证实了DN早期肾组织足细胞损伤中存在明显的PI3K/p-Akt信号通路下调，而活性维生素D对足细胞受损的抑制效果可能与上调该通路有关。

活性维生素D常通过与VDR结合发挥作用。机体中存在细胞核的细胞均能够表达VDR，其中在肺、结肠等部位的淋巴细胞和细胞中表达量较高，足细胞同样也能够表达VDR〔7〕。本研究说明活性维生素D减轻足细胞受损可能与上调VDR的表达有关。

4参考文献

1 Stitt-Cavanagh E，MacLeod L，Kennedy C. The podocyte in diabetic kidney disease〔J〕．Scientific World J，2009; 31(9): 1127-39.

2魏凯，李肖瑛，倪兆慧，等.激活环磷酸腺苷/蛋白激酶信号对药物诱导足细胞损伤的影响〔J〕．中华肾脏病杂志，2013; 29(10): 754-60.

3高慧，王向托，杨立志，等.维生素D与慢性肾脏疾病〔J〕．中国老年学杂志，2013; 33(7): 1710-2.

4邹敏书，余健，聂国明，等.活性维生素D对肾病大鼠的肾脏保护作用〔J〕．解放军药学学报，2010; 26(2): 95-8，封3.

5朱玮玮，陈惠萍，葛永纯，等.糖尿病肾病肾小球滤过膜结构与肾功能及代谢指标的关系〔J〕．肾脏病与透析肾移植杂志，2010; 19(1): 30-5.

6王锋，范亚平，达展云，等.低蛋白合并α-酮酸饮食对被动型Heymann肾炎大鼠肾小球足细胞Nephrin表达的影响〔J〕．山东医药，2012; 52(1): 31-3.

7郑敏.维生素D及维生素D受体的研究进展〔J〕．医学综述，2013; 19(21): 3965-7.

〔2015-02-17修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)