慢性应激对心脏交感神经和室性心律失常易感性的影响*

孙丽芳，杨波，石少波，刘韬，阮兵，梁锦军

基础与实验研究

慢性应激对心脏交感神经和室性心律失常易感性的影响*

孙丽芳，杨波，石少波，刘韬，阮兵，梁锦军

目的：探讨慢性应激对心脏交感神经和室性心律失常易感性的影响。

方法：将30只SD大鼠随机分为对照组和慢性应激组，每组15只。对照组正常条件下饲养，慢性应激组给予慢性不可控应激刺激4周，用旷场试验和糖水试验评估行为学，用短阵快速刺激（Burst刺激）评估麻醉状态下室性心律失常诱发率，采用免疫组化法检测心脏交感神经重构相关指标酪氨酸羟化酶的变化。

结果：造模后，慢性应激组较对照组糖水偏爱比及旷场实验指标显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。麻醉状态下，慢性应激组血压与对照组比差别无统计学意义（P＞0.05），心率较对照组快（P＜0.05），室性心律失常诱发率较对照组高 （P＜0.05）。心肌Masson染色显示：慢性应激组心室肌间质胶原容积分数（3.94±1.81）%高于对照组（2.71±1.64）%，但差异无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化结果：慢性应激组心室肌酪氨酸羟化酶含量（1397.8±268.8）μm2/mm2较对照组（995.0±232.3 ）μm2/mm2增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。

结论：慢性应激能增加室性心律失常的易感性，心脏交感神经重构可能是其重要机制。

慢性应激；室性心律失常；交感重塑

Methods: A total of 30 SD rats were randomly assigned into two groups: Control group, the rats were fed with normal condition and Chronic stress group, the rats were fed with unpredictable chronic stimulus program. n=15 in each group and all animals were treated for 4 weeks. The behavior of rats was assessed by open field test and sucrose intake test, the susceptibility of ventricular arrhythmia was measured by Burst stimulus program under narcosis condition, and the sign of cardiac sympathetic nerve reconstruction, tyrosine hydroxylase content was examined by immunohistochemistry.

Results: Compared with Control group, Chronic stress group had decreased ratio of sucrose favorite/open field test, P＜0.05 and increased susceptibility of ventricular arrhythmia, P＜0.05. Masson staining showed that the ventricular collagen score was similar between 2 groups, P＞0.05. Immunohistochemistry presented that Chronic stress group had much higher tyrosine hydroxylase content (1397.8 ± 268.8) um2/mm2than Control group (995 ± 232.3) um2/mm2, P＜0.05.

Conclusion: Chronic stress may increase the susceptibility of ventricular arrhythmia in experimental rats, and the cardiac sympathetic nerve reconstruction might be an important mechanism.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:270.)

应激与心血管系统功能关系密切，严重的精神刺激损害心脏会导致应激性心肌病，而慢性应激或情绪障碍是心脏病的独立危险因素[1]。心血管疾病患者常常伴有抑郁、焦虑或者愤怒等情绪，处于身体和心理应激状态，慢性应激不仅严重降低患者的生活质量，而且显著增加远期心血管事件发生率[2,3]。研究表明抑郁使心血管疾病患者发生急性心血管事件的风险增加50%，尽管在校正了共存疾病及左心室射血分数后，风险仍然有显著增加[1]。HUNT2研究显示伴有抑郁或焦虑性情绪应激的心肌梗死患者，其心肌梗死再发率显著增高[4]。上述研究提示慢性情绪应激可导致心血管疾病,增加心血管事件发生率。然而其具体病理机制尚未明确，可能与心脏神经重塑所致室性心律失常风险增加有关。为此，本研究通过4周慢性不可预见性慢性应激程序刺激动物，建立以抑郁为主要表现的慢性应激模型，探讨慢性应激刺激对心脏自主神经系统的影响，试图验证上述假设。

1 材料与方法

实验动物分组：本研究时间为2014-02至2014-07。将30只SD大鼠（180～220 g，购于武汉大学实验动物中心，饲养于SPF级实验室）随机分为对照组（n=15）和慢性应激组（n=15）。实验开始前在清洁级实验室适应1周。

慢性应激刺激：慢性应激模型制作参考Gronli等[5]的方法。慢性应激组15只大鼠禁水24 h，潮湿垫料24 h，行为限制2 h，夜间频闪灯8 h，禁食24 h，鼠笼倾斜45度24 h，冰水浴5 min。将上述7种刺激方法随机安排到28 d内，每日1种刺激，同种刺激不连续出现，以使动物不可预料刺激的发生。刺激方案如下（表1）：

表1 慢性应激组15只大鼠刺激方案

行为学评价：采用糖水实验[6]和旷场实验[7]进行行为学评价。糖水实验：大鼠单笼饲养并编号，实验开始前给大鼠进行糖水适应性训练，前12 h均给1瓶1%蔗糖水和1瓶纯水，后12 h交换两瓶水的位置，以防大鼠对饮水形成位置偏好。然后禁水禁食24 h，再给每只大鼠已称重的1%蔗糖水和纯水各1瓶，记录1h后每只大鼠每瓶水的消耗量。计算糖水偏爱百分比[糖水偏爱百分比=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯水消耗量）×100%]。旷场实验：旷场大小为120 cm×90 cm×35 cm，试验在早9:00进行。将大鼠置于旷场中心内，使用动物行为自动跟踪系统（Ethovision3.0）记录并分析大鼠在旷场内10 min的行为：大鼠10 min内的总运动距离，直立次数（两前爪腾空或攀附旷场壁）。单只独立测试，每次测试完成后，均要将粪便清理干净。

心电图和血压监测：动物在麻醉[盐酸戊巴比妥钠，40 mg/（ml·kg）,腹腔注射，美国sigma公司]10 min 后, 游离右侧颈总动脉，远心端结扎，近心端插入动脉导管，记录平均动脉压。同时记录体表Ⅱ导联心电图（PowerLab放大器,澳大利亚AD公司）10 min,运用Chart 7.0软件分析血压和心率。

室性心律失常诱发：在麻醉状态下，进行气管插管，开胸暴露心脏，行短阵快速脉冲刺激（Burst刺激），诱发室性心律失常。Burst刺激程序：将刺激电极置于右心室流出道，行每阵2 s的超速刺激，刺激周长为20 ms,电压为2倍的阈电位。室性心律失常定义为大于2 s的心室快速激动，若未诱发，Burst刺激重复三次。根据室性心律失常的诱发率评价室性心律失常的易感性。本部分实验在10 min内完成。

Masson染色及免疫组化：在电生理实验完成后，迅速取出心脏，将心肌组织固定，脱水，石蜡包埋，每个心肌组织制备5张连续切片,依次滴加Masson复合染色液，磷钼酸，苯胺蓝，最后滴加分化液进行分化。免疫组化一抗为抗小鼠TH抗体（1：200，美国sigma公司），二抗为通用SP抗体（美国sigma公司），参照试剂盒提供的步骤进行染色。使用Image-Pro Plus 6.0软件测定心室肌间质胶原容积分数（胶原面积／全视野组织面

积），比较两组胶原的分布排列及纤维化的面积。使用Image-Pro plus6.0软件对图像进行量化分析，计算阳性纤维或结构在选区中表达量。采用免疫组化法检测心脏交感神经重构相关指标酪氨酸羟化酶的变化。

2 结果

2.1 两组行为学实验结果比较

在造模前，评估两组大鼠糖水偏爱比及旷场实验指标，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。造模后，显示慢性应激组较对照组糖水偏爱比及旷场实验指标显著下降，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。表2

2.2 两组造模后血压、心率、室性心律失常诱发率比较

麻醉状态下，慢性应激组与对照组比血压差别无统计学意义（P＞0.05）；心率较对照组快（P＜0.05），室性心律失常诱发率较对照组高（P＜0.05），差异均有统计学意义。表3

表2 两组行为学实验结果比较

表2 两组行为学实验结果比较

注：与对照组造模后比较*P＜0.05

?

表3 两组造模后血压、心率、室性心律失常诱发率比较

表3 两组造模后血压、心率、室性心律失常诱发率比较

注：与对照组比较*P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

?

2.3 两组Masson染色及免疫组化结果

心肌Masson染色显示：对照组心室肌间质空隙较小，少量胶原沉积；慢性应激组心室肌间质空隙大，心肌纤维排列紊乱，胶原沉积明显（图1）；慢性应激组心室肌间质胶原容积分数（3.94±1.81）%高于对照组（2.71±1.64）%，但差异无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化结果：TH抗体表达量慢性应激组较对照组增多（图2）；慢性应激组心室肌酪氨酸羟化酶含量（1 397.8±268.8）μm2/mm2较对照组（995.0±232.3 ）μm2/mm2增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 两组心室肌切片Masson染色图片（×400）

图2 两组心室肌切片免疫组化图片（×400）

3 讨论

尽管流行病学资料显示长期慢性应激的存在会促进心脏疾病的发生，但其具体的致病机制并不十分清楚。动物实验显示慢性应激可导致心率变异性下降，心肌纤维化加重，心脏传导系统受损，从而促进心律失常的发生[8]。临床发现存在情绪应激的患者，多伴有心脏交感神经功能亢进[9]。心脏交感神经密度增加则促进了室性心律失常的发生[10]。焦虑抑郁情绪可能加重炎症反应及内皮功能损害[11]，而抗抑郁药物能够减少室性心律失常的发生[12]。为此我们拟通过慢性不可预见性温和应激程序建立模型，采用心脏电生理及免疫组化等手段探讨慢性应激与心律失常相关性及其可能存在的机制。

研究模型参照Willner等的研究，糖水偏爱比的下降提示快感缺乏，而旷场相关指标的下降显示自发活动减少。本实验发现慢性应激组大鼠糖水偏爱比及旷场实验指标均显著降低（P＜0.01），表明本实验慢性应激性刺激具有可行性、可靠性、有效性[6, 13-15]。

交感神经兴奋最直接的反应是心率增快，而血压更多受心输出量、外周血管阻力、内分泌影响。本实验在麻醉状态下慢性应激组心率较对照组加快（P＜0.01）,血压无明显差别，室性心律失常诱发率显著升高（P＜0.01），提示慢性应激组大鼠存在交感神经功能亢进。

交感神经末梢与心肌形成突触联系，去甲肾上腺素是其释放的主要神经递质之一，交感神经高支配现象的发生可诱导心肌对儿茶酚胺产生超敏现象，使心肌复极离散度增加，构成触发、启动，甚至维持恶性心律失常的重要机制[16]。

另有研究发现心脏交感神经增生使心室肌瞬时外向钾电流通道蛋白的表达减少，电流密度下降，从而引起复极延缓，导致心律失常易感性增加[17]。

酪氨酸羟化酶是儿茶酚胺合成的限速酶，本身具有不会接受吲哚的衍生物的性质，因此具有高度的特异性，可以作为交感神经特异性标志物，慢性应激大鼠心室肌中酪氨酸酶表达量的升高，提示心室交感神经密度增加[18]。从而印证了我们的推论：慢性应激通过影响心脏交感神经重构而增加了室性心律失常的易感性。

总而言之，越来越多的研究表明长期慢性应激已成为心血管疾病的发生、发展重要因素之一。而慢性应激引起交感神经重构的机制尚需更深层次的研究。对于心血管疾病患者，如何有效预防及治疗慢性情绪应激也应引起我们的重视。

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Effect of Chronic Stress on Cardiac Sympathetic Nerve Function and Susceptibility of Ventricular Arrhythmia in Experimental Rats

SUN Li-fang, YANG Bo, SHI Shao-bo, LIU Tao, RUAN Bing, LIANG Jin-jun.
Department of Cardiology, Wuhan University People’s Hospital, Wuhan (430060), Hubei, China

Objective: To investigate the changes of cardiac sympathetic nerve function and susceptibility of ventricular arrhythmia at chronic stress condition in experimental rats.

Chronic mild stress; Ventricular arrhythmia; Sympathetic reconstruction

2014-09-04）

（编辑：王宝茹）

中央高校基本科研业务费专项资金资助（2014302020201）；湖北省基金重点项目（2014CFA061）；国家自然科学基金（81200139）

430060 湖北省武汉市，武汉大学人民医院 心血管内科

孙丽芳 硕士研究生 主要研究方向为心律失常研究 Email:summer19871105@163.com 通讯作者：杨波 Email:yybb112@whu.edu.cn

R54

A

1000-3614（2015）03-0272-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.03.018