苜蓿根瘤菌菌株发酵生产工艺优化

张欣，杨旭升，程国立，曹亚彬

（黑龙江省科学院生物肥料研究中心，哈尔滨150086）

苜蓿根瘤菌菌株发酵生产工艺优化

张欣，杨旭升，程国立，曹亚彬

（黑龙江省科学院生物肥料研究中心，哈尔滨150086）

本研究对传统苜蓿根瘤菌发酵培养基——YMA培养基进行优化，用较为廉价的麸皮替换其中的碳源甘露醇，并添加豆饼粉，以增加氮源，设置不同的添加比例与浓度，根据发酵过程中菌体数量的变化，筛选出较佳的培养基配方：麸皮0.5g+豆饼粉1.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+MgSO40.20g+NaCl0.10g+蒸馏水1 000mL。

苜蓿根瘤菌；发酵；培养基

生物固氮是指通过固氮微生物固氮酶系的催化将空气中的分子态氮转化成氨态氮的过程，是地球上氮循环的一个重要组成部分。生物固氮将空气中的氮气直接转化为植物可利用的硝酸盐或铵盐，可为植物提供氮素，取材方便、成本低廉，还可降低因施用化肥引起的环境污染，提高土壤肥力［1-3］。近年来，豆科植物与根瘤菌共生固氮受到了专家学者的广泛关注。对豆科植物根瘤菌的生产工艺进行优化，不仅能够降低成本、提高产量，同时可大大减少工业合成氮肥的施用量，减轻污染、改良土壤、促进农业可持续发展［4-7］，因此具有重要的经济、社会和生态效益。

1　材料与方法

1.1供试菌株

苜蓿根瘤菌SM33，由黑龙江省科学院生物肥料研究中心保藏。

1.2培养基

1.2.1YMA液体培养基

甘露醇10.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+ MgSO40.20g+NaCl0.10g+蒸馏水1 000mL，pH值为6.8～7.2。

1.2.2优化培养基

将传统YMA培养基中的碳源甘露醇替换为廉价麸皮，并添加氮源豆饼粉，设置二者不同比例、不同浓度。共设5个处理：麸皮0.25%+豆饼粉0.5%（处理1）、麸皮0.25%+豆饼粉1.0%（处理2）、麸皮0.5%+豆饼粉0.5%（处理3）、麸皮0.5%+豆饼粉1.0%（处理4）、麸皮1.0%+豆饼粉1.0%（处理5）。

1.3实验器材

本实验所用主要器材见表1。

表1　实验器材Tab.1 Experimental apparatus

1.4实验方法

1.4.1菌株活化

将保藏的苜蓿根瘤菌菌株接种到YMA固体培养基平板上，在电热恒温培养箱28℃条件下培养3d，挑选生长旺盛的菌落进行再培养，纯化分离出单一菌落［8］。

1.4.2种子液制备

把活化后的菌株，接种到YMA培养基中，放入空气浴振荡器中，28℃条件下振荡培养。按照平板计数法，测定培养液的活菌数量，使其达到2.0× 109/mL［8］。

1.4.3菌株发酵培养

分别配制YMA液体培养基及5种优化培养基各500mL，分装于5瓶500mL锥形瓶中，每瓶装量100mL，向其中各接入2mL种子液，放入空气浴振荡器中，28℃、150rad/min条件下振荡培养。

1.4.4菌株生长状况测定方法

将各锥形瓶中的发酵液分别在不同时间段取样，利用革兰氏染色、常规染色法进行苜蓿根瘤菌生长状况检测，血球计数法结合平板稀释活菌计数法计算苜蓿根瘤菌数量。

2　结果与分析

2.1菌株在传统YMA液体培养基中的生长状况

将YMA液体培养基中的发酵液分别在培养后8h、12h、18h、24h、30h、36h、40h取样，检测菌体生长状况并计算菌体数量（取平均值），结果见图1：

图1　苜蓿根瘤菌在YMA培养基中的生长Fig.1 The growth of Alfalfa Rhizobium in YMA medium

从图1可以看出，培养时间在0～36h内，苜蓿根瘤菌菌体数量随发酵时间的延长呈现上升趋势，在培养至36h最多，达6.67×108/mL。当培养至40h时，菌体衰亡，数量下降。

2.2菌株在优化培养基中的生长状况

将5种优化培养基中的发酵液分别在培养后8h、12h、18h、24h、30h、36h、40h取样，检测菌体生长状况并计算菌体数量（取平均值），结果见图2：

从图2可以看出，将传统YMA培养基中的碳源甘露醇替换为廉价麸皮，并添加氮源豆饼粉后，5个处理在各培养时间段内菌体数量均有所增加，其中增量最大的是处理4，即麸皮0.5%+豆饼粉1.0%，在培养至36h时菌体数量最多，达17.45×108/mL。

图2　苜蓿根瘤菌在不同培养基中的生长Fig.2 The growth of Alfalfa Rhizobia in different culture medium

3　结论

麸皮和豆饼粉价格低廉、取材方便且来源广泛，而甘露醇等药品的成本较高，不适合应用于大规模工业生产。本研究将传统YMA培养基进行优化，将其中的碳源甘露醇以廉价麸皮代替，并添加豆饼粉作为氮源，设置不同添加比例、添加浓度，根据发酵过程中苜蓿根瘤菌菌体数量的变化，得到较佳的培养基配方，即麸皮0.5g+豆饼粉1.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+ MgSO40.20g+NaCl0.10g+蒸馏水1 000mL，利用这一配方，生产出了活菌数达17亿/mL以上的苜蓿根瘤菌菌剂，节约了生产成本并达到了促进生长的目的，为实现产业化和大面积推广应用提供了理论依据。

［1］陈文新，陈文峰.发挥生物固氮作用，减少化学氮肥用量［J］.中国农业科技导报，2004，6（6）：3-5.

［2］郭春景.微生物肥料及其微生态效应研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2004．

［3］Evans H J，Burns R H.1992.Highlights in biological nitrogen fixation during the last 50 years［C］//In：Stacey G Burris R H，Evans H J，eds.Biological Nitrogen Fixation.NewYork，London：Chapman&Hall，Inc.1．

［4］马晓彤，刘惠琴，宁国赞.我国苜蓿根瘤菌与苜蓿共生固氮优良组合研究进展及前景［C］//第二届中国苜蓿发展大会暨牧草种子、机械、产品展示会论文集，2003．

［5］宁国赞，刘惠琴.中国豆科牧草根瘤菌资源的采集保藏及利用［J］.草地学报，1999，7（2）：165-172．

［6］宁国赞，李元芳，刘惠琴.我国豆科牧草根瘤菌选育及应用研究的进展（1981～1988年）［J］.中国草地，1989，（03）：68-72．

［7］DILWORTH，M.1966.B.B.A.Distribution in soybean,common bean,and alfalfa［J］．J Plant Nutr,1998,21（3）：477-485．

［8］杨琼博.pH值和化合态氮对紫花苜蓿结瘤和固氮效果的影响［D］.哈尔滨：东北农业大学，2007.

Process Optimization of Alfalfa Rhizobium Strains Fermentation

ZHANGXin,YANGXu-sheng,CHENGGuo-li,CAOYa-bin
(Research Center ofBioFertilizer ofHeilongjiangAcademyofSciences,Harbin 150086,China)

This studyoptimized the traditional alfalfa rhizobia fermentation medium-YMA medium,replaced the carbon source ofmannitol with cheaper bran,and added bean cake powder,in order to increase the nitrogen source,set different adding proportion and concentration.According to the changes of the number of bacteria in the fermentation process,the better culture medium formula was selected:bran 0.5g+bean cake powder 1.0g+K2HPO40.25g+KH2PO40.25g+MgSO40.20g+NaCl0.10g+distilled water 1000ml.

Alfalfa Rhizobia;Ferment;Culture medium

Q948

A

1674-8646（2015）09-0044-02

2015-07-01