高脂饮食致大鼠脂肪肝实验模型的建立

张 伟 巴图得力根 韩志强 娜日苏

1.内蒙古民族大学临床医学院，内蒙古 通辽 028007;2.内蒙古通辽市医院，内蒙古 通辽 028007;3.内蒙古民族大学附属医院蒙药临床药理研究所，内蒙古 通辽 028007

随着人们膳食结构的改变，加上缺乏运动等原因，脂肪肝的发病率逐渐增高。目前，西方发达国家中的脂肪肝发病率为10%～24%，而我国脂肪肝发病率也成为病毒性肝炎之后的第二大肝病，上海和广州两地，脂肪肝的发病率就高达20%。如果不及时治疗，将会进一步恶化，导致肝纤维化甚至肝硬化，严重影响人们的身体健康，给家庭和社会带来很大的负担。本实验旨在探讨脂肪肝模型的复制方法，为进一步研究脂肪肝发病机理提供一种较好的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 高脂饲料配方 胆固醇(批号:F20030410)、脱氧胆酸钠(批号:F20030410)、吐温80 (批号:F20030410)、1-2 丙二醇(批号:F20030410)均为分析纯，够自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司;丙赛优(批号:030505，上海朝晖药业有限公司);猪油自制。

1.1.2 脂肪乳的配制［1］按12.5%吐温80、10%1-2 丙二醇、0.5%丙基硫氧嘧啶、15%猪油、1% 脱氧胆酸钠、5%胆固醇的比例配制。先将猪油30g 放在200ml 的烧杯中，放在磁力搅拌器上加热至40℃水浴中融化，加入10g胆固醇、1g 研细的丙基硫氧嘧啶，充分搅匀，加入适量吐温不断搅拌直至乳化现象产生，制成油相。另一烧瓶中加入30ml 蒸馏水和1-2 丙二醇20ml，加热至60℃，然后加入胆盐2g 溶解，制成水相。将两个烧杯液体充分混匀即可成为稳定的脂肪乳剂，使用时37℃水浴融。

1.1.3 普通饲料 玉米面35.45%，白面29.55%，麸皮12.5%，豆粉12%，鱼粉8%，酵母粉2%。

1.1.4 试剂盒 TG、TC 测定试剂盒(北京福瑞生物工程公司);AST、ALT 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法 雄性清洁级Wistar 大鼠28 只(SCXK 吉-20110-0004)，体重(200±10)g。随机抽取8 只作为对照组，用生理盐水灌胃每日1 次，35 d 后腹腔静脉抽血行血脂四项及肝功能检测、肝重测定以及肝脏病理检查。其余20 只大鼠作为高脂乳剂组行脂肪肝模型复制，用高脂乳剂灌胃每日1 次，饲养后的第14、28d 各取5 只大鼠处死，第35d 另取10 只大鼠和对照组8 只大鼠一同处死，腹腔静脉抽血行血脂四项及生化检测、肝重测定以及肝脏病理检查，观察肝脏脂肪变性程度。实验前动物禁食12h，用10%的水合氯醛以0.35ml/l00g［2］体重经腹腔内注射麻醉后开腹，腹下腔静脉采血，取3ml 全血室温静置15min，3000r/min 离心30min 分离血清，备测血脂四项、肝功。各组大鼠于肝右叶取300mg 肝组织标本，冰水中制成10%的匀浆，4℃4000r/min 离心10min，提取上清液，用酶法测定TG、TC 含量。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 检测指标 AST、ALT、TC、TG、LDL、HDL 含量;肝匀浆TG、TC 的含量;检测肝组织病理。

1.3.2 检测方法 ①肝功能及血脂四项指标AST、ALT、TC、TG、LDL、HDL 采用全自动生化分析仪检测。②肝匀浆TG 和TC 用全自动生化分析仪检测。③组织病理观察:病理诊断是判断脂肪肝程度的金标准。取材后经10%福尔马林固定3h 后，梯度酒精逐级脱水，石蜡包埋，冷冻，切片厚5μm，HE 染色观察肝脏细胞脂肪变程度和范围。依据脂肪肝评分标准进行评分。

1.4 疗效判定标准组织学疗效评估参照Brunt 等［3］制订的脂肪变分级标准，即0 级:肝细胞脂变细胞占0～5%;I级:肝细胞脂肪变细胞占5%～33%;II 级:肝细胞肪变细胞占33%～66%;III 级:肝细胞脂肪变细胞占66%以上。采用生化指标AST、ALT、TC、TG、LDL、HDL，肝匀浆TG 和TC，来判定肝功能和血脂的疗效。

1.5 统计分析 利用SPSS 13.0 统计软件包对数据进行整理分析，计量资料以(±s)表示，采用t 检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物情况 高脂乳剂灌胃饲养10d 后大鼠皮毛蓬乱而无光泽，精神萎靡，食欲不振，体重减轻。生理盐水组大鼠体重呈增加趋势。

2.2 大鼠体重、肝重、肝指数 与生理盐水组相比，高脂乳剂组肝指数(肝湿重/体重×100%)在第4 周末明显升高(P＜0.05)，第5 周末这种差异性仍然存在。高脂乳剂组大鼠体重明显小于生理盐水组，肝重相对于高脂乳剂组呈上升趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。见表1.

表1 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠体重、肝重、肝指数的比较(±s)

表1 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠体重、肝重、肝指数的比较(±s)

注:与生理盐水组比较，* P ﹤0.05。

2.3 血脂水平情况 高脂乳剂组血清中TC、TG、LDL-C含量从第2 周末就有明显上升(P＜0.05)，而HDL-C 则明显降低(P＜0.05)。且该趋势在第4、5 周末仍然存在差异性。见表2、表3.

表2 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠TG、TC 的比较(±s)

表2 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠TG、TC 的比较(±s)

注:与生理盐水组比较，* P ﹤0.05。

表3 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠HDL-C、LDL-C 的比较(±s)

表3 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠HDL-C、LDL-C 的比较(±s)

注:与生理盐水组比较，* P ﹤0.05。

2.4 大鼠肝功能的变化 与生理盐水组相比，高脂乳剂组血清中ALT、AST 从第2 周末就明显上升(P＜0.05)，且该趋势在第4、第5 周末仍然存在差异性。其中以ALT 变化更为显著。

表4 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠ALT、AST 的比较(±s)

表4 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠ALT、AST 的比较(±s)

注:与生理盐水组比较，* P ﹤0.05。

2.5 肝内脂质变化 高脂乳剂组肝匀浆TG、肝匀浆TC 从第2 周末就有明显上升(P＜0.05)，且该趋势在第4、第5 周末仍然存在差异性。其中以肝匀浆TC 变化更为显著。见表5。

表5 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠肝匀浆TG、TC 的比较(±s)

表5 生理盐水组和高脂乳剂组大鼠肝匀浆TG、TC 的比较(±s)

注:与生理盐水组比较，* P ﹤0.05。

2.6 肝脏组织学改变 高脂乳剂组大体见肝表面有油腻感，锇酸染色光镜下第14d 肝细胞内有少量脂滴，第28d约1/ 3 肝细胞含有细颗粒状脂滴，第35d 约2/ 3 以上肝细胞内出现脂滴，肝窦被挤压变窄，肝细胞形态不规则。生理盐水组肝脏则未见以上改变。见图1。

3 讨论

脂肪肝是多种病因引起的肝脏脂肪变性，流行病学调查显示，酒精和肥胖是引起慢性脂肪肝的主要原因。20世纪80年代末期日美学者利用B 超检查发现，正常人群脂肪肝发病率约为的10%，而肥胖患者的发病率为50%，嗜酒者的发病率为57.7%。脂肪肝的发病机理至今尚未明确，但通常认为脂肪肝的形成与脂肪代谢障碍有关，是肝细胞脂肪合成增加和氧化减少所致，肝细胞中的甘油三酯、极低密度脂蛋白合成和排出不平衡是形成脂肪肝的原因。目前，高脂血症动物造模方法各异，但主要有先天性、转基因和化学物质诱导的三种实验性动物模型［4］。前两种由于来源困难和代价昂贵，且与人类脂肪肝的形成特点不符合，限制了其应用，导致高脂饲料喂养或灌胃形成的实验动物模型在国内应用最为广泛。但高脂血症动物模型与其他疾病动物造模比较，存在周期过长、费用过高或模型组血脂水平参差不齐等缺点。张东等［5］通过实验结果证明，在猪油和胆固醇的基础上加入丙基硫氧嘧啶，在10d、20d、30d时CHO 和LDL 均升高、且HDL 显著降低，但TG 未见变化;在猪油和胆固醇的基础上同时加入胆盐和丙基硫氧嘧啶，各项指标在不同时期差异均有显著性，说明本配方可以造成理想的高脂血症模型，且造模所需时间最短，10d 即可，稳定性较高，随时间延长，血脂水平也不断升高。倪鸿昌等［6］又在以上配方基础上提出用高脂饲料改良方诱导的脂肪肝动物模型，因其病理特征与人类相似，4 周成为稳定脂肪肝模型，且价格低廉，方法简单而被广泛使用。本实验在倪鸿昌等高脂配方基础上又加以改动，用高脂饲料乳剂每日灌胃诱导大鼠脂肪肝，锇酸染色显示，第14d出现较多的脂滴积累;第28d 超过2/3 以上的细胞内均出现脂滴，并随时间延长小泡状脂滴有相互融合的趋势;第35d 由于肝细胞内充满脂肪空泡，将核推向一边，肝细胞形态不规则，肝窦变窄，不规则。体重小于正常大鼠，肝重大于正常大鼠，可能由于高脂饲料胆固醇高，妨碍鼠的生长发育，致呈现皮毛蓬乱而无光泽，精神萎靡，食欲不振。

［1］倪鸿昌，李俊，金涌，等.大鼠实验性高脂血症和高脂血症性脂肪肝模型研究［J］.中国药理学通报，2004，20 (6):703-706.

［2］曾民德.脂肪肝［J］.中华消化杂志，1999，19 (2):120-122.

［3］Brunt EM，JarmeyC G，Di Bisceglie AM，et al.Nonalcoholics teatohepatitis:a Proposal for grading and staging the histological lesions ［J］.Am J Gastroenterol，1999;94:2467-2474.

［4］.Matteoni CA，Younossi ZM，Gramlieh T，et al.Nonalcoholic fattyliverdisease:aspectrum of clinical andpathological sevedty ［J］.Gastroenterology，1999，116:1413-1419.

［5］张东，武海军，陈士萍，等.人鼠实验性高脂血症五种造模方法的比较［J］.中国药理学通报，2007，23 (9):1254-1256.

［6］.刘嵩，卢笑丛，葛建，等.高脂所致脂肪肝动物模型建立的动态研究［J］.中国药理学通报，2006，22 (11):1399-403.