HPLC 法测定乙肝宁颗粒中二苯乙烯苷含量

尹思泳 陈钟扬 梁华伦 黎 奔

广东省中医院，广东 广州 510120

何首乌为常用中药材，在医疗和保健中使用广泛，具有补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨，化浊降脂功效，是中医补肝肾的主要药物之一［1］。2014年7月，国家食品药品监督管理局通过中央电视台等新闻媒体发布国家药品不良反应病例报告数据库陆续收到口服何首乌及其成方制剂导致肝损伤的病例报告，经对相关病例进行分析并结合有关文献报道综合评价，认为口服何首乌及其成方制剂与肝损伤发生有一定相关性，指出口服何首乌及其成方制剂引起的肝损伤多呈可逆性，停药或对症治疗后，预后多较好。但是，超剂量、长期连续用药等可能增加其风险［2］。乙肝宁颗粒属于国家中药保护品种，由黄芪、丹参、何首乌、茵陈、川楝子等13 味中药组成，具有补气健脾、活血化瘀、清热解毒等功效，临床用于治疗急慢性肝炎［3］。方中何首乌的主要有效成分是二苯乙烯苷和结合蒽醌［1］，然而药典质量标准中含量测定项仅有黄芪的黄芪甲苷和白芍的芍药苷［1］，而无何首乌的有效成分二苯乙烯苷含量的测定。目前，有不少文献报道了对其他成分含量分析的报道［3～4］，但很少有对何首乌有效成分测定的报道。为此，本研究采用HPLC 法测定乙肝宁颗粒中二苯乙烯苷的含量，对保证其临床用药安全，减少或杜绝药源性肝病具有积极的意义，同时为该药的全面质量控制提供参考依据。

1 仪器和试药

实验仪器:美国安捷伦1200 液相色谱仪(带DAD 检测器和自动进样器);试药:乙肝宁颗粒 (201401571，201401581 和201401591 三批，湖南某药业股份有限公司，购自老百姓大药房);二苯乙烯苷对照品(批号为110844-200908，购自中检所);甲醇购自默克公司，色谱纯，其他试剂为分析纯，去离子水为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

2.1.1 提取方法的选择 超声法:取乙肝宁颗粒(批号201401571)适量，约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50% 乙醇50ml，称定重量，超声处理 (功率120W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，作为供试品溶液。

回流法:取供试品(批号201401571)，按超声法操作，将“超声30min”改为“回流30min”，其余同超声法制备。

分别取上述两种溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果如下(见表1)。

表1 不同提取方法的试验结果 (n=3)

从表1 可以看出，采用超声法测定结果高于回流法。

2.1.2 提取溶剂的选择 为了获得最优提取溶剂，本实验根据二苯乙烯苷的溶解特性，分别采用水、稀乙醇(50.0%)以及甲醇作为溶剂进行提取。取乙肝宁颗粒(批号201401571)，照2.1.1 法中超声法，分别用水、稀乙醇(50.0%)、甲醇进行提取制备供试品溶液，分别测定样品中二苯乙烯苷的含量。结果见表2。

表2 不同溶剂试验结果 (n=3)

从表2 可以看出稀乙醇的提取效率高于甲醇、水。这可能是由于乙肝宁颗粒在水溶液的环境中溶化性较好，在溶解于水中后，二苯乙烯苷再分散于稀乙醇所致。

2.1.3 提取时间的选择 为了获得最优提取时间，取乙肝宁颗粒(批号201401571)3 份，以甲醇为提取溶剂，按超声法，分别超声处理15min，30min，60min，制成供试品溶液，分别测定二苯乙烯苷的含量。结果见表3。

表3 提取时间对二苯乙烯苷含量的影响 (n=3)

从表3 可以看出，随着超声时间的延长，样品溶液中的二苯乙烯苷浓度增加，到30min 左右达到峰值，随后基本稳定。可能原因是超声15min 时样品中二苯乙烯苷提取不完全，在超声30min 到达峰值后已经提取完全。因此选择30min 作为本品提取时间。

综上，乙肝宁颗粒中二苯乙烯苷的最佳提取方法为:取本品约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，滤过，即得。

2.2 对照品溶液的制备 取经二苯乙烯苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml 约含5mg 的溶液，其他浓度的对照溶液采用稀释法稀释制备，各浓度对照溶液冷藏，备用，整个过程避光操作。

2.3 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(25∶75)为流动相，检测波长为320nm，流速为1.0ml/min，柱温35℃，进样量10μl，以外标标准曲线法定量。

2.4 方法专属性 精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入HPLC，记录色谱图，由色谱图提示，在对照品色谱相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，空白溶剂(流动相)在此峰位置无吸收，对本品中二苯乙烯苷含量测定没有干扰，方法专属性良好。

2.5 标准曲线的绘制 精密量取浓度约为5mg/ml 的二苯乙烯苷对照品溶液1000、200、20 和10μl 至10ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列梯度溶液。分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按含量测定方法测定，记录色谱图。以对照品的浓度(mg/ml)为横坐标(x)，测得的峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。得回归方程:y=268.7x-16.86，r=1。结果表明，二苯乙烯苷对照品浓度在0.005～5mg/ml 之间与其峰面积呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取浓度为0.1mg/ml 的二苯乙烯苷对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，重复连续进样6 次，测定二苯乙烯苷峰面积，此时，二苯乙烯苷峰面积的RSD=0.12%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密量取同一二苯乙烯苷对照品溶液，分别在0、8、16 和24h 按上述色谱条件注入液相色谱仪，测定二苯乙烯苷峰面积，此时二苯乙烯苷峰面积的RSD=0.68%，表明二苯乙烯苷对照品溶液在此条件下稳定性良好。

2.8 重复性 取同一批供试品(批号201401571)6 份，参照上述提取方法，按含量测定方法测定，记录峰面积，计算含量，测得该批号乙肝宁颗粒中二苯乙烯苷的含量为0.056mg/g，RSD=0.93% (n=6)，表明该方法重复性良好。

2.9 回收率测定 取同一批已知含量(批号201401571)的供试品6 份，按照样品含量的100%将二苯乙烯苷对照品溶液加入到样品中，依上述最优提取条件进行提取，制备回收溶液，注入高效液相色谱仪，每份重复进样2 次，共12 次，记录色谱图，计算回收率。结果见表4。

表4 回收率试验结果 (n=2)

2.10 样品测定 实测样品3个，每个2 份，共计6 份，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用标准曲线法计算二苯乙烯苷含量。结果见表5

表5 样品测试结果表

5 讨论

乙肝宁颗粒属于国家中药保护品种，也是补气健脾、活血化瘀、清热解毒的常用药物之一，在《中国药典》2010 版未对其主要成分何首乌进行质量控制。笔者为建立何首乌中有效成分二苯乙烯苷的含量测定方法，在试验过程中对提取方法、提取溶液、提取时间三个因素进行了考查，最终确定提取条件为采用稀乙醇(50%)为提取剂，用超声萃取的方法提取乙肝宁颗粒中的二苯乙烯苷。建立了高效液相色谱法测定乙肝宁颗粒中二苯乙烯苷的含量的方法，结果表明二苯乙烯苷含量为0.005～5 mg/ml 之间呈良好的线性关系，专属性强，回收率在96.79%～101.08%之间，且操作简便、准确，重现性好，灵敏度高，阴性对照发现无干扰。本实验为乙肝宁颗粒进一步的质量标准控制提供了技术支持。

［1］国家药典委员会.中国药典(一部) ［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:164.

［2］国家食品药品监督管理局.药品不良反应信息通报［B/OL］http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0051/102902.html，2014-7-26.

［3］张秋蓉，周浓，杨敏.HPLC 测定乙肝宁颗粒中川楝素［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16 (10):78-79.

［4］梁国华，罗秀伟.高效液相色谱法测定乙肝宁颗粒中芍药苷含量［J］.中国药业，2008，17 (1):29-30.