利多卡因对兔心室肌细胞动作电位的影响及对快钠电流的阻滞作用

李晶 杨震 赵籥陶 周刚 刘德平

利多卡因是临床常用的Ⅰb类抗心律失常药物，主要用于室性心律失常的治疗。其主要电生理作用机制是抑制动作电位（action potential，AP）的早期内向电流。Gintant等［1］的研究表明利多卡因类似物QX-314对动作电位最大上升速率（Vmax）有明显的使用依赖性阻滞，在一定频率范围内，频率越快，阻滞作用越明显。目前鲜有研究通过直接检测钠电流评估利多卡因对AP和钠通道的使用依赖性阻滞。本研究以兔心室肌细胞作为材料和对象，采用微电极技术和全细胞膜片钳技术，以利多卡因进行灌流干预，检测兔心室肌细胞AP和快钠电流（INa-T）的变化，以较快频率刺激，评估利多卡因对INa-T的使用依赖性阻滞作用，从而为临床上心动过速尤其是室性心动过速时应用利多卡因提供依据和指导。

1 材料与方法

1.1 兔心室肌细胞的分离

选取成年新西兰大白兔（体重1.8～2.3 kg，10只，SPF级），肌肉注射甲苯噻嗪镇静，经耳缘静脉给予肝素钠（200 IU/kg）抗凝，氯胺酮麻醉（35 mg/kg，静脉注射）后迅速切除分离心脏，置于无钙台氏液中。主动脉根部分离后经升主动脉插管连接于灌流系统中。所有的灌流液在37℃条件下用95%O2-5%CO2发泡，维持灌注压于75 mmHg。先以无钙台氏液灌流10～15 min，继以酶液（Ⅰ型胶原酶0.5 g/L、蛋白酶0.05 g/L、小牛血清白蛋白0.4 g/L+无钙台氏液）灌流20 min后快速取下心脏，剪切分离左室心肌，尼龙网过滤，并在室温下储存在含有1 mmol/L Ca2+的KB液中（mmol/L）：L-Glutamic acid 50，KCl 40，KH2PO420，Taurine 20， MgCl23，KOH 70，EGTA 0.5，HEPES 10，Glucose 10，用KOH调定pH值至7.4。只有耐钙、杆状、横纹清晰，并且无自发性收缩的细胞方被用于实验。

1.2 电生理检测

1.2.1 AP的记录 跨膜电压使用3 mol/L KCl充灌微电极进行记录，温度条件为37℃，电极阻抗在20～40 MΩ。通过记录电极起搏细胞，周长稳定为1 s，脉宽1 ms，起搏电压为阈电位的120%。药物灌流时间足以达到稳态的药物效应。检测分析AP的最大舒张期电位、Vmax、AP振幅，以及复极化20%、50%和90%的 AP 时程（APD20、APD50、APD90）。 连续检测 10个AP并取参数平均值。

1.2.2 全细胞膜片钳技术 采用硼硅玻璃电极，充罐电极内液后阻抗≈1.0～2.0 MΩ。细胞外液组分为（mmol/L）： NaCl 10， CsCl 130， MgCl21.0，CaCl21.0，HEPES 5，Glucose 10，CoCl20.3，然后用 NaOH 调定pH值为7.4。电极内液组分为（mmol/L）：NaCl 10，CsF 110，CsCl 20，EGTA 5，Mg-ATP 5，HEPES 5，调定pH值为7.4。在倒置显微镜下，利用三维液压微操纵器使得电极尖端接近细胞，补偿液接电位，之后继续向细胞壁施压，并负压吸引，直到形成高阻封接，封接阻抗＞1 GΩ，给予快电容补偿之后吸破细胞膜，形成全细胞记录模式，再补偿慢电容和串联电阻，待破膜电压稳定后，记录电流。先以空白细胞外液记录快钠电流，然后以细胞外液为母液配制100 μmol/L利多卡因溶液［2］，用蠕动泵以2 ml/min流速灌流细胞池，灌流3 min后记录 INa-T。全细胞电流用Axopatch 200 A放大器进行记录，在5 000 Hz的低通电流滤过，经Digidata 1200 A/D的脱线界面在5 000 Hz予以数字化处理。

1.2.3 利多卡因对INa-T的张力性阻滞和使用依赖性阻滞 张力性阻滞以钳制电位-90 mV 15 s后阶跃至-30 mV，持续20 ms，诱发INa-T，并记录电流值。使用依赖性阻滞在钳制电压-90 mV持续15 s后，由-30 mV的一串40次连续脉冲刺激（持续20 ms）诱发。频率5 Hz（刺激间隔时间为200 ms）。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 利多卡因对兔心室肌细胞AP的影响

100 μmol/L利多卡因灌流后兔心室肌细胞最大舒张电位无明显变化［（-81±7）mV比（-80±6）mV，P=0.102］。 AP 振幅显著降低［（100 ±12） mV比（127±9）mV，P=0.002］。 Vmax明显减慢［（328±41） V/s比（422 ±45）V/s， P=0.004］。 复极化20%、50%时的 AP时程（APD20、APD50）无显著变化［（5 ±2）ms比（7 ±3）ms，P=0.245；（14 ±3）ms比（16 ±6）ms，P=0.156］，复极化90%时的 AP 时程（APD90）显著缩短［（66 ±8）ms比（85 ±10）ms，P=0.021］（图1）。

2.2 利多卡因对INa-T的张力性阻滞作用

经100 μmol/L利多卡因灌流后，钠电流由（3 223±367）pA 减低为（2 468 ±389）pA（P=0.003）（图2）。

2.3 利多卡因对INa-T的使用依赖性阻滞作用

以5 Hz频率刺激，利多卡因灌流前，第40个刺激诱发的电流与第1个刺激诱发的电流分别为（3 145±323）pA 和（3 287 ±432）pA，INa-T未显示出明显的使用依赖性阻滞（P=0.087）。100 μmol/L利多卡因灌流后，在第1个刺激表现出INa-T张力性阻滞的基础上，第40个刺激诱发的电流较第1个刺激诱发的电流明显减小（1 125±298）pA比（2 365±376）pA，P=0.013）（图3）。

3 讨论

本研究采用微电极技术对利多卡因对兔心室肌细胞AP的作用进行了研究，结果表明利多卡因降低AP振幅，减慢Vmax，同时缩短了APD90。Burashnikov等［3］的研究表明利多卡因在浓度为10 μmol/L时，能够轻度缩短心房和心室肌细胞的APD90，并选择性地延长心房肌细胞的有效不应期（effective refractory period，ERP），抑制心房肌细胞的兴奋性，延长传导时间和降低Vmax。本研究中利多卡因表现出了显著地降低心室肌细胞的Vmax，这种心房肌和心室肌所表现出的不同反应考虑可能与选用利多卡因浓度不同有关，但尚需进一步证明。Carmeliet等［4］的研究表明利多卡因缩短APD的原因是阻滞平台期TTX敏感型通道即钠通道所致，利多卡因在缩短APD的同时缩短了ERP，且缩短ERP更为显著，因此相对延长了APD。同时该研究还表明利多卡因抑制起搏活动，从而降低细胞的自律性，Vmax的减慢可减慢传导，这些都是利多卡因抗心律失常作用的电生理机制。

本研究还采用全细胞膜片钳技术对利多卡因对INa-T的作用进行了探讨，结果表明利多卡因不但对INa-T具有张力性阻滞，且具有明显的使用依赖性阻滞作用，即在快频率（本研究为5 Hz）时，表现出对INa-T明显的阻滞作用。

图1 利多卡因对兔心室肌细胞AP的影响

图2 利多卡因对INa-T的张力性阻滞作用

图3 利多卡因对INa-T的使用依赖性阻滞

使用依赖性阻滞是钠通道的一个十分重要的电生理学特征，指的是钠通道阻滞药物对钠通道的阻滞作用与钠通道活动的频率相关，在一定频率范围内，频率越快，药物的阻滞作用就越明显，即钠通道“使用”越多，药物对钠通道的阻滞作用越显著。使用依赖性阻滞以一种频率依赖性的方式延长了不应期，是多种药物抗心律失常作用的基础和研究热点［5-6］。其机制主要是通道在去极化时被瞬间激活，胞内激活门迅速开放，去极化的反复循环将更多的激活通道暴露于药物，当通道开放越频繁，激活门开放也越频繁，这些药物与受体部位的结合就越迅速，最终表现为使用依赖性阻滞效应。定位突变研究已经表明药物的受体部位是一个三维结构域，由钠通道的Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ结构域的S6片段的氨基酸残基形成［7-8］。S6是离子通道孔道的结构成分，参与控制通道对离子的选择性和通透性。新近研究显示孔道部位的突变与通道的离子选择性相关。

Gintant等［1］以犬心肌浦肯野纤维作为研究对象，以其动作电位的Vmax作为观察手段，探讨了利多卡因类似物QX-314的使用依赖性阻滞作用。结果显示，当刺激周长由2 s缩短为700 ms时，利多卡因类似物QX-314使浦肯野纤维动作电位的Vmax逐渐由500 V/s减低至420 V/s，当刺激周长由700 ms延长至20 s时，Vmax又恢复至空白对照组的水平。本研究进一步探讨了利多卡因对兔心室肌细胞动作电位上升支的基础离子通道INa-T的使用依赖性阻滞作用，得到了类似结论，与Gintant等的研究有互补性，进一步表明和证实了利多卡因对钠通道的使用依赖性阻滞作用。

总之，本研究结果表明，利多卡因对INa-T不但有张力性阻滞作用，使用依赖性阻滞更为明显。使用依赖性阻滞是INa-T的一个重要的电生理特征，值得进一步研究探讨，更需要在临床工作中加以注意。