荜茇宁衍生物对高脂血症大鼠调脂作用及其机制的研究

阿 荣，乔延江，博·格日勒图，昭日格图，包力尔

(1.内蒙古农业大学理学院，内蒙古呼和浩特 010020;2.北京中医药大学中药学院，北京 100102;3.北京中医药大学中药信息工程研究中心，北京 100102;4.内蒙古大学蒙药化学研究所，内蒙古呼和浩特 010021)

高脂血症(Hyperlipidemia，HLP)是一种代谢性疾病，表现为一种或几种脂类代谢失调导致的血浆中脂类含量异常，常引起动脉粥样硬化，冠心病，心肌梗死等疾病［1］。研究也表明HLP的预防治疗可以减少心脑血管疾病的发生，提高生活质量。但是现今治疗HLP的药物如他汀类调脂药和贝特类调脂药，其不良反应影响临床应用，因此寻找安全，有效，低毒的降脂药物具有一定的积极意义。

荜茇宁(GBN)是从常用中蒙药胡椒科藤本植物荜茇(Piper longum L.)中提取分离出的有效单体成分，具有降脂作用，但其降脂程度有限［2］。因此本课题组在荜茇宁基础上进一步得到其去烃基衍生物(GBNT)(化学式如图1)，来探讨其对高脂血模型大鼠是否具有调脂作用，是否更有治疗效果。

1 材料

1.1 实验动物 Wister大鼠，体重(200±10)g，清洁级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证［SCXK(京)2012－0004］。室内温度控制在(23±2)℃，大鼠自由饮食和摄水。

1.2 药物与试剂 GBNT由本课题组制备，其纯度高于98.0%;辛伐他汀片，购于广东彼迪药业股份有限公司(批号20140303);总胆固醇测定试剂盒(TC)，甘油三酯测定试剂盒(TG)，低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(LDL-C)，高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(HDL-C)均购于中生北控生物科技股份有限公司;卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(LCAT)，低密度脂蛋白受体(LDLR)均购于Epitmics公司;胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)购于Abcam公司;β-actin购于碧云天生物技术研究所;BCA试剂盒购于cwbiotech公司。

1.3 仪器 PRONTO EVOLUTION全自动生化仪，意大利产;上海骥辉科学分析仪器有限公司;BSA/24S型电子天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司;真空冷冻干燥机，意大利TELSTAR;UV－1601紫外可见分光光度计，日本岛津;迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪，北京市六一仪器厂;ChemiDocTM XRS凝胶成像系统，Bio－Rad公司。

2 方法

2.1 分组及给药 60只Wistar大鼠，随机分为六组:正常组，模型组，GBN组，GBNT低剂量组，GBNT高剂量组，阳性组(辛伐他汀)，每组10只。参照文献［3－4］，制备高脂饲料，除正常组外，其余每组每天给予定量高脂饲料，正常组给予基础饲料。GBN组灌服 10 mg·kg－1·d－1，阳性组灌服 10 mg·kg－1·d－1，GBNT 低剂量组灌服 5 mg·kg－1·d－1，GBNT 高剂量组灌服 10 mg·kg－1·d－1，正常组和模型组每天灌服等体积溶媒，连续给药8周后各组大鼠腹主动脉取血，并取肝脏标本。血清及标本－80℃冻存，进行各项指标的检测。

2.2 血脂测定 按照试剂盒说明书进行血清TC，TG，LDL-C，HDL-C 含量检测。

2.3 肝脏病理形态学检测 将固定好的肝脏标本，进行石蜡包埋，切片，HE染色。

2.4 Western blot 收集处理过的样本，加入裂解液裂解，离心，获得蛋白样品。用BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白上样，SDS凝胶电泳，转膜，封闭，加入一抗4°C孵育过夜。次日加二抗孵育后曝光。

3 结果

3.1 GBNT对高血脂模型大鼠血脂水平的影响相对于正常组，模型组中血清TC，TG，LDL-C含量显著升高(P ＜0.01)，HDL-C 含量下降(P ＜0.01)，具有统计学意义;实验组中GBNT低、高剂量组能显著抑制模型中血清 TC，TG，LDL-C含量的上升，HDL-C含量的下降(P＜0.01)，具有统计学意义;GBN组和辛伐他丁阳性组中大鼠血清中TC，TG，LDL-C含量也均有下降(P＜0.05)，HDL-C(P＜0.05)含量上升;其中GBNT低剂量组降脂效果就与GBN相当，高剂量组降脂效果优于GBN组，且具有统计学意义(P＜0.05);同时GBNT高剂量组调节TC，TG，HDL-C比辛伐他丁阳性组更好，无统计学意义，但有一定趋势，见表1。

表1 GBNT对大鼠血脂TC，TG，LDL-C，HDL-C含量的影响(±s)

表1 GBNT对大鼠血脂TC，TG，LDL-C，HDL-C含量的影响(±s)

注:aa P ＜0.01 vs正常组;b P ＜0.05，bb P ＜0.01 vs模型组;c P ＜0.05 vs GBN 组。

组别 剂量/mg·kg－1·d－1 TC/mmol·L －1 TG/mmol·L－1 LDL-C/mmol·L －1 HDL-C/mmol·L －1正常组 —1.96 ±0.43 0.95 ±0.25 1.42 ±0.33 0.62 ±0.13模型组 — 12.33 ±2.32aa 2.46±0.77aa 9.38±2.02aa 0.19 ±0.04aa阳性组 10 5.83 ±1.79bb 2.07 ±0.82 5.86 ±1.27bb 0.23 ±0.05b GBN 组 10 8.02 ±2.23bb 1.42 ±0.56bb 5.40 ±1.13bb 0.48 ±0.13bb GBNT 低剂量组 5 9.26 ±2.16b 1.95 ±0.60b 6.22 ±1.46b 0.45 ±0.09bb GBNT 高剂量组 10 7.14 ±1.96bb 1.31 ±0.34bb 5.08 ±1.29bb，c 0.62 ±0.15bb，c

3.2 病理学检测GBNT对高血脂模型大鼠肝组织的保护作用 正常组肝组织染色均匀，结构清晰完整，肝细胞形状较为一致，呈多边形，未见脂肪病变(见图2A);模型组肝细胞数目减少，形态各异，排列紊乱，体积变大，细胞间隙出现空泡，发生脂肪变性，并有大量炎性细胞浸润(见图2B);辛伐他汀组肝脏有水肿表现，出现一些空泡，有脂肪颗粒变性，但与模型组相比较，脂肪变性有所改善，肝损伤有所恢复(见图2C)。GBN组及GBNT低剂量组显示出肝细胞有稍微空泡现象，有轻度肝细胞脂肪变性，无水肿表象，较模型组有所改善(见图2D，见图2E);GBNT高剂量组可以观察到肝细胞肿胀、脂肪变性的程度较之模型组均很大改善，肝细胞数目增多，结果也较为完整，趋于正常细胞(见图2F)，其恢复程度优于GBN组。

3.3 GBNT对高血脂模型大鼠肝脏脂质关键代谢酶及LDLR含量的影响 如图3所示，相对于正常组，模型组中LCAT，LDLR，CYP7A1表达量皆下降，辛伐他汀阳性组、GBN组、GBNT低、高剂量组皆能极显著的提高LCAT，LDLR，CYP7A1表达量;其中GBNT低剂量组提高LCAT，CYP7A1表达与GBN组相当，在提高LDLR表达量上优于GBN组;GBNT高剂量组皆优于GBN组和阳性组;说明GBNT组在调节高脂血模型大鼠肝脏脂质关键代谢酶更具优势。

4 讨论

高脂血症也可以称之为血脂代谢紊乱征，高含量血脂可使肝脏成为一个油库，经血液循环后，致使血液凝稠，产生血稠，阻塞血管壁，导致冠心病，心肌梗死等心脑血管病的产生，而且发病年龄逐年提前，影响人们生活质量。从中药材中寻找有效单体成分及其衍生物进行调血脂已成为热点，并且已有报道胡椒碱的衍生物中GBN具有预防小鼠酒精性脂肪肝作用，但有一定毒性且药效不显著［5－6］，因此本课题组在GBN基础上进行结构改造获得其衍生物GBNT，并发现其具有显著调血脂作用。

正常生理状态下，血脂处于稳态，当发生异常时，TC会沉淀在血管壁上，TG会促进凝血异常，产生血栓，导致动脉粥样硬化，甚至是冠心病;LDL-C参与TC的运输，从肝脏中运往肝外组织中，过高的话，也会沉淀于血管壁上，呈现粥样化，导致动脉粥样硬化。HDL-C可以把肝外组织中的TC运到肝脏中进行分解，代谢为胆汁酸排除体外，当其含量降低的时候，会导致血浆中胆固醇发生聚集，导致血栓或动脉粥样硬化。因此调节血脂含量有助于降低动脉粥样硬化等疾病。本实验结果发现高脂饲料饲养可使大鼠血清 TC，TG，LDL-C含量显著升高，HDL-C含量下降，说明高脂血症模型大鼠建立成功，与文献报道一致［7－8］;通过给药发现，GBN组，辛伐他汀阳性组和GBNT组都能抑制此变化，其中GBNT低剂量组和GBN组改善程度一致，高剂量组效果优于GBN组。

肝脏是胆固醇生成的主要场所，当血脂含量升高，容易诱发肝细胞肿胀“变性”坏死，造成肝细胞损害。高血脂模型组中，肝细胞发生脂肪变性、肿胀，肝细胞胞浆疏松化，严重者呈气球样变，与陈梅霞［7］，Liu［8］等学者报道基本一致，而不管是阳性对照组还是GBNT治疗组都一定程度上减轻肝细胞肿胀，缓解肝脏脂肪病变等受损症状，但GBNT使肝组织恢复程度更好，更具优势。

从膳食或者肝脏中获得的大部分LDL-C能特异性结合LDLR，胞饮进入溶酶体降解，保持较正常水平，因此LDLR在一定程度上能够反映血液中胆固醇的含量［9］。Bell［10］，Pauta［11］等学者报道 LDLR－/－小鼠可以作为高血脂模型小鼠，进一步说明LDLR改善高血脂症中的重要性。正如 Dong［12］，Zhang［13］等学者阐述，高脂血模型组LDLR表达量下降，经8周连续给药后发现，GBNT低、高剂量组皆能上调LDLR表达，效果皆优于GBN组。

LCAT是促进HDL-C运转肝外游离胆固醇到肝脏中进行分解代谢的关键酶，从而维持机体胆固醇稳态，避免动脉粥样硬化等疾病的产生。一定程度上也说明 LCAT活性决定了 HDL-C生成量［8，14］。CYP7A1是胆汁酸合成经典途径的限速酶，其活性的提高可以促进肝脏中TC分解成胆汁酸，排除体外，机体内50%左右的 TC的清除都依赖于CYP7A1的活性［15］。长期摄入高脂饲料会使LCAT［13，16］，CYP7A1［2，17］表达量下降，通过给药发现，GBNT低、高剂量组皆能上调LDLR、CYP7A1表达，其中低剂量组与GBN治疗效果相当，高剂量组疗效更好。

从而得出GBNT可以调节高血脂模型大鼠血脂水平，恢复肝功能，是通过提高LCAT和CYP7A1表达，促进HDL-C生成，达到清除TC，TG，LDL-C的目的，但更具体机制还有待进一步探讨。

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