复方二黄颗粒对肾衰大鼠肾脏纤维化的抑制作用

潘卉萱，刘建社，张 春，黄 杰

(1.安徽省立医院肾内科，安徽合肥 230001;2.华中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科，湖北武汉 430022)

慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)是危害人类健康的危重病之一，随病程进展，建存的肾单位发生代偿性增生，而这种代偿性机制可导致肾小球进一步硬化、肾小管间质的损伤，肾单位进一步减少，最终进展为慢性肾衰竭。目前对于慢性肾衰竭的疗法除营养疗法、替代疗法、及肾脏移植等治疗方法外，尚无其它特效的治疗方法。替代疗法如血液透析、腹膜透析等方法均不能改善肾组织的病理损害，且有不同程度的副作用，肾移植又存在着肾源缺乏和排斥反应等缺陷;因此深入研究肾间质纤维化的机制，控制肾间质纤维化的发展对延缓肾脏疾病的进展至关重要。中医药治疗类似肾炎病证的历史悠久，可改善肾组织血液循环、调节免疫炎症反应、调节氧化应激，延缓慢性肾脏疾病的进程，在改善慢性肾脏疾病进展方面有一定优势。复方二黄颗粒是有大黄、黄芪、水蛭等组方而成的复方中药颗粒剂，具有益肾、活血化瘀、补气、扶正祛浊的功效。本实验通过观察复方二黄颗粒剂对肾大部切除肾衰大鼠的肾脏病理的影响，并采用免疫组化法观察肾组织中TGF-β1(转化生长因子-β1)、FN(纤维连接蛋白)、α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)的表达变化。

1 实验材料

1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠30只，10～12周龄，体重(250±20)g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供，动物质量合格证号:scxk(鄂)2004－2007，适应性喂养1周。

1.2 实验药物 复方二黄颗粒剂由华中科技大学同济医学院附属协和医院研制生产，批号20051206。

1.3 实验试剂 兔抗鼠FN的多克隆抗体、兔抗鼠TGF-β1的多克隆抗体(滴度为 1∶50)、兔抗鼠 α-SMA的多克隆抗体、SP免疫试剂盒、DAB试剂盒(购于博士德公司)。

1.4 实验仪器 华中科技大学同济医学院千屏HPIAS－2000型图像仪。

2 实验方法

2.1 模型制备［1－2］手术组大鼠予用3%戊巴比妥钠45 mg·kg－1，经腹腔注射麻醉后，俯卧固定于温暖手术台上，剪毛，从距左脊肋骨1.5 cm处斜向外下方切口，暴露左侧肾脏，分离肾包膜及脂肪后，用丝线离断结扎上下级肾组织各约1/3，出血明显者用明胶海绵压迫止血片刻，复位肾脏，腹腔注射青霉素每千克72万单位，逐层缝合。1周后同样方式切除整个右肾，两次手术共切除5/6肾脏。假手术组麻醉后切开皮肤及肌肉层，仅分离肾脏包膜，不切除肾脏，手术后，腹腔注射青霉素，逐层缝合。先行切除左肾的2/3，1周后同样方式切除整个右肾，两次手术共切除5/6肾脏。假手术组10只仅切开皮肤及肌肉层，仅分离肾脏包膜，不切除肾脏。

2.2 实验分组 实验大鼠随机分为假手术组、模型对照组和药物治疗组，每组各10只，假手术组因麻醉意外死亡1只。根据药物临床用量，计算［3］治疗组予以复方二黄颗粒按3.13 g·kg－1灌胃给药;假手术组和模型对照组每日给予等量生理盐水灌胃。

2.3 观察指标 在药物灌胃第8周后处死大鼠。取各组大鼠部分肾组织，于光镜下观察肾组织的病理变化;对上述组织切片进行 TGF-β1、FN、α-SMA免疫组化染色。

2.4 结果分析 结果采用华中科技大学同济医学院千屏HPIAS－2000型图像分析软件对肾组织免疫组化结果进行半定量分析，根据阳性面积占整个测量面积的百分比，计算出百分率。计算肾组织着色面积与面积的比值。肾小球硬化指数和肾小管间质病变指数经对数转化后，按连续变量处理。连续变量采用(±s)表示，三组定量数据的比较采用单因素方差分析的方法;三组之间两两比较采用最小显著差法(LSD-t);计数资料采用卡方检验。P ＜0.05，为有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况 实验期间，假手术组大鼠表现机警，反应快，皮毛致密、整齐而有光泽，生长、进食及活动情况均无明显异常;肾大部切除组明显营养不良，精神萎靡，活动迟缓，食欲不振，皮毛蓬松、枯槁无光泽，治疗组大鼠与假手术组大鼠一般表现无太大差别，只是皮毛干燥无光，活动慢。

3.2 病理改变

3.2.1 双肾的大体解剖 正常组:双肾成蚕豆样外观，无肿大，颜色红褐色质地坚实有光泽;切面皮质红褐色，髓质浅红色，皮、髓质界线清晰;包膜结合紧，不易剥离。其它两组与正常组相比，大鼠残肾代偿性肥大，肾脏肿胀、体积增大，呈灰褐色，缺乏光泽，表面有多数隆起，和周围组织黏连;切面皮质变薄，皮髓质分界不清。治疗组大鼠肾脏较模型对照组大鼠肾脏颜色稍红润，肿胀相对轻，质地稍坚实。

3.2.2 显微镜观察肾脏病理改变 假手术组肾小球、肾小管及间质无明显改变，排列分布及形态均正常。模型对照组大鼠肾小球大小极不一致，大多数肾小球肿大，包曼囊内有多少不等的渗出物，毛细血管球内有糖原(PAS)染色红染物质明显增多沉积于系膜和毛细血管周围。肾小球有核细胞数增多，以系膜细胞、内皮细胞和足细胞增多为主。系膜基质增生。肾小球呈局灶节段性硬化，肾小管上皮细胞浑浊肿胀，部分小管萎缩、坏死，有管型形成，管腔闭塞或扩张，被纤维组织所取代。肾间质大量炎症细胞浸润，间质纤维组织增生，面积增宽。

与假手术组比较，模型对照组的肾小球积分及肾小管间质积分均显著增高 (P＜0.01);与模型对照组比较，复方二黄颗粒剂可以降低肾小球积分，明显改善降低肾小管间质积分(P＜0.05)。见表1、图1。

表1 各组大鼠的病理积分(±s)

表1 各组大鼠的病理积分(±s)

注:与假手术组比较，△P＜0.01;与模型对照组比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 。

组别 n 肾小球积分 肾小管间质积分假手术组9 0.18 ±0.09 0.35 ±0.18模型对照组 10 0.82±0.34△ 1.32±0.41△治疗组 10 0.40±0.51＊＊ 0.64±0.37*

3.2.3 复方二黄颗粒剂对肾组织 TGF-β1、FN、α-SMA表达的影响 假手术组中，TGF-β1的阳性表达仅在少数肾小管主要在上皮细胞内有微量表达，以胞浆着色为主，肾小球有少量表达。模型对照组TGF-β1主要表达于肾小球基底膜和脏层上皮细胞，萎缩或扩张的肾小管上皮细胞，尤其在肾间质有单核细胞浸润处的远端和近端肾小管上皮细胞内;部分内皮细胞和系膜区也可见少量阳性表达。

假手术组中，FN仅少量表达于肾间质基质及肾小球中，主要表现为系膜基质、肾小管基底膜出现极少量棕黄色颗粒。而模型对照组中，FN在系膜基质、肾小管上皮细胞基底部、肾小管间质表现出强阳性表达，出现大量棕黄色颗粒。

假手术组中，α-SMA仅在血管平滑肌细胞呈阳性表达，肾小球、肾小管及间质偶见阳性表达;模型对照组中，α-SMA表达主要在皮质区及皮髓交界处的肾小管及间质区的细胞浆，部分肾小管上皮细胞及其周围间质区表达明显，且与局部间质增宽及肾小管病变程度一致;在肾小球内可见少量表达，以肾小球血管极多见。

与假手术组比较，模型对照组大鼠肾组织中TGF-β1、FN、α-SMA 的表达显著增强(P ＜0.01);与模型对照组比较，治疗组大鼠肾组织中 TGF-β1、FN、α-SMA的表达显著降低 (P＜0.01)。见表2、图2～4。

表2 各组大鼠肾组织免疫组化检测结果比较(±s)/%

表2 各组大鼠肾组织免疫组化检测结果比较(±s)/%

注:与假手术组比较，△P ＜0.01;与模型对照组比较，*P ＜0.01。

组别 n TGF-β1 FN α-SMA假手术组9 1.78 ±0.43 1.17 ±0.34 0.78 ±0.41模型对照组 10 9.12 ±0.71△ 9.35 ±1.52△ 10.65 ±1.54△治疗组 10 4.65 ±0.57* 5.47 ±0.81* 6.22 ±0.63*

4 讨论

医学研究发现，慢性肾衰竭最终导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化，促使CKD进展的机制众多，肾单位的高滤过、高代谢、肾组织上皮细胞表型转分化、细胞因子过度分泌、氧化应激等因素均可加重肾损害，并且，各种因素互为因果、相互影响形成一个复杂的网络。在复杂的细胞因子网路中，TGF-β1是最关键的促纤维化生长因子，它可刺激胶原、纤维连接蛋白(FN)、蛋白多糖的表达，促进ECM的产生同时抑制其的降解。同时，许多过度表达的细胞因子都通过TGF-β1介导胶原沉积引起肾纤维化［4－6］。FN是ECM成分中变化最早、最敏感的促肾小球硬化成分，其合成增加在一定程度上代表了ECM的过度积聚。同时FN也是一种重要的调理介质，局部FN和胶原的堆积又促进成纤维细胞、肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞的增殖、转分化及肾脏纤维化的形成［7－8］。α-SMA是多种肾脏固有细胞向肌成纤维细胞表型转化的标志性蛋白。正常肾脏组织中，仅血管平滑肌细胞强阳性表达α-SMA，其它肾脏固有细胞通常不明显表达α-SMA;病理状态下，肾组织出现病理损伤后α-SMA表达上调，导致肾脏固有细胞被激活出现转分化，表明肾脏固有细胞由静止表型转化为增殖表型或分泌表型，肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞、肾间质成纤维细胞等表达α-SMA标志着它们被激活和异常增殖，具有肌成纤维细胞的特征，即发生了细胞表型转化;同时，转分化的细胞又主动合成和分秘细胞外基质(ECM)，表达并自分泌多种炎症介质，促进肾小球硬化、间质纤维化［9］。

中医中药是我国治疗肾脏疾病的特色，中医学认为慢性肾衰竭是病位以肾为主并累及多个脏腑，其基本病机是本虚标实;本虚以肾元亏虚为主，标实为水气、湿浊、湿热、血瘀、肝风之证，目前许多中医研究表明瘀血、浊毒、湿热、水湿都参与了疾病的全过程。中医的“血瘀”涵盖了肾小球血管病变、基质增多、固有细胞转分化、肾小管间质纤维化等病理变化。而活血和络、泄浊解毒、清利湿热等方法治疗均有效。复方二黄颗粒根据中医对慢性肾衰竭“虚、瘀、毒、浊”组方，主要由大黄、黄芪、水蛭等组成。大黄是掌叶大黄、药用大黄、唐古特大黄的干燥根或根茎，具有降泄、排浊毒、祛瘀生新等作用。大黄可增加氮质从肠道排出，减轻患者的氮质血症，并具有改善患者血液的高凝状态、抑制肾脏固有细胞增殖、减少肾组织ECM聚积、调节脂质代谢紊乱等作用［10－12］。黄芪是内蒙黄芪或膜荚黄芪的干燥根，味甘，性微温，含有黄芪皂甙、黄芪总黄酮、黄芪多糖、多种氨基酸等有效成分，具有益气固本、利尿消肿等功效。黄芪具有双向免疫调节和抗氧化功能，还可改善肾脏微循环、促进肾组织对有害抗原的清除、促进肾小球基底膜的修复、减轻肾组织的氧化应激反应、抑制细胞凋亡，从而保护肾功能［12－14］。水蛭具有破血，逐瘀，利水功效，其含有水蛭素、肝素和抗血栓素等活性成分，具有抗凝、抗血栓形成、降低血液黏稠度、改变血液流变学的作用，且水蛭素还可减轻肾小球系膜细胞增生、减少纤维蛋白沉积，从而可延缓肾衰竭的进展［15］。

本实验观察到，复方二黄颗粒改善了肾大部切除后慢性肾衰竭大鼠的生活状态及残肾的肾脏病理改变，降低了残肾组织中 TGF-β1、FN、α-SMA的表达，减少ECM的聚集，减轻肾小球硬化和肾间质纤维化，延缓慢性肾衰竭的进展，对慢性肾衰竭大鼠肾脏具有一定的保护作用。其作用机制可能与部分下调肾脏下调TGF-β1、FN、α-SMA的表达，减少细胞外基质的过度沉积，减少肾脏固有细胞的转分化，减少肾小球内细胞增生等作用有关。

综上所述，笔者的研究结果显示，复方二黄颗粒可以预防性阻止残余肾组织的代偿性增生和肥大，延缓肾小球硬化、抑制肾脏纤维化。对临床上中西药联合治疗延缓慢性衰竭进展具有一定的参考意义。

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