连桂清心片的薄层色谱鉴别

2015-12-14郭俊玮宋乐乐

安徽医药 2015年10期

郭俊玮，宋乐乐

(蚌埠医学院第一附属医院药剂科，安徽蚌埠 233004)

连桂清心片主要由甘草、黄连、丹参、生地等多味药材组成的复方制剂，功效以活血化瘀、理气止痛为主，临床上主要用于气滞血瘀所致胸痹、胸闷、心前区刺痛、舌质紫暗以及具有上述症候的冠心病、心绞痛等病症。文献报道具有益气养阴、活血通络、清心复脉等功效的连桂清心片，对心肌缺血有明显的保护作用，有重要的开发价值［1］。薄层色谱法(TLC)作为色谱法的一个分支，因其独具的设备简单、操作简便快捷、结果直观、兼具分离鉴定双重功能等优点而被广泛应用于药物分析中，尤其是应用于中药分析。为了有效控制该制剂的质量，本文采用薄层色谱法，以甘草酸铵、盐酸小檗碱为对照，对制剂中的甘草、黄连进行薄层色谱鉴别试验，建立可用于该制剂质量控制的薄层定性鉴别方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器电子天平(AB204S，梅特勒托利多公司)，超声波清洗机(CH250，天津恒奥科技公司，频率33 kHz)，电热恒温鼓风干燥箱(CZX－GF101－4－SⅡ，上海贺德实验设备有限公司)。

1.2 试药连桂清心片(天津中新药业集团，批号:061106、061108、061110);甘草酸铵对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110731－200306);甘草对照药材(中国药品生物制品检定所，批号:0904－9605);盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号:0713－9906);黄连对照药材(中国药品生物制品检定所，批号:0913－8802);硅胶G薄层板，规格100 mm ×100 mm，厚度0.20～0.25 mm(青岛海洋化工厂分厂);化学试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 甘草的薄层色谱鉴别

2.1.1 连桂清心片供试品溶液的制备取本品15片，研细，加乙醚40 mL，超声30 min，滤过，向残渣中加入30 mL甲醇，超声30 min，过滤，收集滤液，蒸干滤液，向残渣中加入40 mL纯净水使残渣溶解，使用正丁醇溶液提取3次，每次使用20 mL正丁醇溶液，合并正丁醇液，用纯净水洗涤3次，蒸干，向残渣中加入5 mL甲醇使残渣溶解，以此溶液配置得到连桂清心片供试品溶液。

2.1.2 甘草酸铵对照品溶液的制备取甘草酸铵对照品，加入甲醇制成每1 mL含2 mg甘草酸铵的溶液，以此溶液配置得到对照品溶液。

2.1.3 甘草对照药材溶液的制备加甲醇30 mL，超声30 min，过滤，蒸干滤液，向残渣中加入40 mL纯净水使残渣溶解，使用正丁醇提取3次，每次20 mL正丁醇，合并所有正丁醇液，用水洗涤3次，蒸干，向残渣中加入5 mL甲醇使残渣溶解，以此配置得到甘草对照药材溶液。

2.1.4 缺甘草阴性对照溶液的制备根据连桂清心片的处方和工艺制备缺甘草的阴性对照样品，按照“2.1.1”项下制备供试品溶液的方法处理，以此配置得到缺甘草阴性对照品溶液。

2.1.5 TLC法检测按TLC法(《中国药典》一部(2010年版)附录ⅥB)进行试验［2］，分别吸取上述方法配置的连桂清心片供试品溶液、甘草对照药材溶液、甘草酸铵对照品溶液以及阴性对照品溶液各1μL，在硅胶G薄层板上点样(用0.1%氢氧化钠溶液快速浸过，取出，晾干，于105℃烘干并活化1 h)，以乙酸乙酯—甲酸—冰醋酸—水(15∶1∶1∶2)作为展开剂，展开，取出硅胶G薄层板，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色变清晰，在365 nm紫外光灯下检视。配置的连桂清心片供试品溶液色谱中，在与甘草对照药材色谱相对应的位置，荧光斑点显示相同颜色;在与甘草酸铵对照品溶液色谱相对应的位置上，荧光斑点显示相同的橙黄色;分离良好且缺甘草的阴性对照溶液色谱显示无干扰，见图1。

2.2 黄连的薄层色谱鉴别

2.2.1 连桂清心片供试品溶液的制备取本品1片，研细，加甲醇5 mL，加热溶液回流15 min，过滤，滤液中加入甲醇至5 mL，以此溶液作为连桂清心片供试品溶液。

2.2.2 盐酸小檗碱对照品溶液的制备称取对照品盐酸小檗碱，加入甲醇中配置成每1 mL溶液含0.5 mg盐酸小檗碱的溶液，以此作为盐酸小檗碱对照品溶液。

2.2.3 黄连对照药材溶液的制备另取黄连对照药材粉末50 mg，加甲醇5 mL，加热回流15 min，滤过，滤液补加甲醇使成5 mL，以此作为对照药材溶液。

2.2.4 不含黄连阴性对照溶液的制备根据连桂清心片处方和工艺制备没有黄连的阴性对照溶液，按照“2.2.2”项下制备供试品溶液的方法，以此配置得到不含黄连阴性对照品溶液。

2.2.5 TLC法检测按照TLC法(《中国药典》一部(2010年版)附录ⅥB)试验，分别吸取上述方法配置的连桂清心片供试品溶液、黄连对照药材溶液、盐酸小檗碱对照品溶液以及不含黄连阴性对照品溶液各1μL，点样于同一硅胶G薄层板上，置一侧加有5 mL氨水的双槽层析缸中，以苯—乙酸乙酯—异丙醇—甲醇—水(6 ∶3 ∶1.5∶1.5∶0.3)为展开剂，蒸汽预饱和15 min，上行展开，展距约为8 cm。取出硅胶G薄层板，晾干，在365 nm紫外光灯下检视。连桂清心片配置的供试品溶液色谱中，在与黄连对照药材色谱相对应的位置上，荧光斑点显示相同的黄色;在与盐酸小劈碱对照品色谱相应的位置上，荧光斑点显示相同的黄色;分离良好且不含黄连阴性溶液色谱显示无干扰，见图2。

3 讨论

3.1 甘草甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch).、胀果甘草(Glycyrrhiza inflta Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根和根茎。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛和调和诸药的作用。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒和缓解药物毒性、烈性。甘草中含有甘草酸、甘草甜素、二氢黄酮、甘草次酸、光甘草酚和异光果甘草苷等数百种化合物，其中皂苷类、黄酮类和多糖类是甘草最重要的生理活性成分［3］。三萜类成分具有生理活性强、含量高等特点，已从甘草属植物中鉴定出61种三萜类化合物，其中45种为皂苷元成分，均为3-β齐墩果烷型化合物的衍生物。三萜类化合物甘草酸及甘草次酸为甘草中主要有效成分，它们都有促肾上腺皮质激素的生物活性可用作抗炎药［3－4］。药理研究还发现甘草酸除有抗变态反应活性外，还具有非特异性的免疫加强作用。作为我国重要的中药资源，甘草以其资源丰富、成分多样、临床应用广泛等特点在我国传统中医药中占据着重要的位置。随着对其化学成分研究的不断深入，越来越多的具有药用价值的生物活性化合物得以发现和提取，不同品种甘草之间的生物学特性及药理作用也日趋明显，由此我们提示在科学研究以及临床用药方面应加强对甘草品种的区分，以使甘草的应用价值得到更进一步得提高。此外甘草中还含有乌拉尔甘草皂苷A、乌拉尔甘草皂苷B［5］，这些皂苷均属于五环三萜类皂苷中的齐墩果烷型，又称β-香树脂烷型。其苷元均为甘草次酸，只是与两分子葡萄糖醛酸的连接位置或构型有所不同，其具体名称、结构见图3、表1。这些化合物亦是处方工艺提取的目标物质。在前处理提取中有文献采用酸水解制得皂苷元再进行薄层鉴别［6］，但由于酸水解条件剧烈且水解后需以强碱调节pH因而可能会造成真正的皂苷元在此过程中发生结构改变，进而影响鉴别的专属性和可靠性。本试验中依据以上皂苷的结构和溶解性质并结合文献方法［7－8］，用皂苷提取的通用方法，即先使用无水乙醚提取除去亲脂性的杂质，残渣以甲醇超声提取滤过后蒸干再以水转溶，用正丁醇自水相中萃取、蒸干得总皂苷。

在以正丁醇自水相中萃取总皂苷时，两相间产生的乳化层较为严重，影响了萃取操作的进行。这是由于皂苷结构中同时含有亲脂性的苷元和亲水性的糖链使之具有一定的表面活性所造成的，经采用一些常用的破乳方法如长时间静置、加热、向体系中加入少量的水相(水)或有机相(正丁醇)溶剂发现效果并不明显。后依据盐析法的原理向水相中加入适量的氯化钠使水相的溶解能力达到饱和，经试验证明破乳效果良好，乳化层几乎完全消失。

在以普通硅胶G薄层板展开、显色后，发现斑点重迭严重、分离度很差，这可能是由于皂苷结构中一些极性较大的基团，如苷元上和糖链中葡萄糖醛酸的羧基、以及糖链中较多的羟基与固定相中的硅醇羟基通过氢键缔合产生较强的吸附作用所造成的。通过采用将硅胶G薄层板以0.1%氢氧化钠溶液快速浸过，取出，晾干，于105℃烘干并活化1 h的方法将固定相中的硅醇羟基位点适当的封闭、钝化，经试验证明以此法处理后的薄层板展开、显色后斑点圆整、分离度良好。

经薄层展开后以10%硫酸乙醇溶液为显色剂在105℃下加热利用强酸使环上取代基脱除增加双键结构，再经双键移位、双分子缩合等反应形成共轭系统，又在酸作用下生成阳碳离子而呈色。由于其苷元母核结构中本身就含有共轭双键，因而呈色较快，斑点显色清晰后置紫外光灯(365 nm)下检视其荧光斑点显示具有较好的鉴别效果，且方法简单重现性好。

表1 甘草中主要皂苷化合物

3.2 黄连黄连为毛茛科植物黄连(Coptis chinensis Franch.)、三角叶黄连(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao.)或云连(Coptis teeta Wall.)的干燥根茎。清热燥湿，泻火解毒。用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，心悸不宁，血热吐衄，目赤，牙痛，消渴，痈肿疔疮;外治湿疹，湿疮，耳道流脓。酒黄连善清上焦火热。用于目赤，口疮。姜黄连清胃和胃止呕。用于寒热互结，湿热中阻，痞满呕吐。现代药理学研究表明，除了其原有的传统的医药价值及使用范围外，黄连中的有效成分及其提取物其尚具有抗炎、抗氧化、抗腹泻、解热、降血脂、降血糖、增强人体免疫力以及保护心血管系统的作用。新的药理作用及新用途的发现为黄连这一传统中药材的进一步开发利用提供了可靠的依据。目前，萸黄连舒肝和胃止呕。用于肝胃不和，呕吐吞酸。黄连的主要药理作用包括抗炎、抗病原体、抗毒素、抗心律失常、抗细菌、抗腹泻、镇静催眠、降血糖和抗溃疡等。黄连的主要有效成分是异喹啉类生物碱，已经分离出的生物碱化合物包括小檗碱、巴马丁、黄连碱、甲基黄连碱、药根碱和表小檗碱等［9］，其具体名称、结构见图4、表2。这些化合物亦是处方工艺提取的目标物质。其中以小檗碱的含量最高，可达10%左右，且以盐酸盐的状态存在于黄连中。除木蓝碱属于阿朴芬型外，其余都属于原小檗碱型，为苄基异喹啉衍生物同时又都是季铵型生物碱，它们具有明显的抗菌消炎、抑制肿瘤和心血管活性［10－11］。在试验中依据它们的溶解性质使用甲醇热回流提取，参考文献［12］和药典［2］进行展开剂的选择并确定药典中黄连药材鉴别项下所使用的展开剂分离效果较好。选择盐酸小檗碱为对照品进行薄层展开，并根据其结构特点即具有芳香大共轭体系、刚性共平面结构和含有较多的如甲氧基、偕氧亚甲基等紫外吸收助色团因而具有较高的荧光效率，采用置紫外光灯(365 nm)下检视，结果表明鉴别效果良好，且方法简单重现性好。