杜氏盐藻与4 种海洋微藻间的化感作用*

2015-12-13潘远健金刚代建国丁莉张丽君栾崇林于化泓

深圳职业技术学院学报 2015年3期

潘远健，金刚，代建国，丁莉，张丽君，栾崇林，于化泓

（1.深圳职业技术学院深圳市大规模细胞培养技术和细胞资源库公共技术服务平台，广东深圳 518055；2.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西南昌 330031）

PAN Yuanjian1，2, JIN Gang1, DAI Jianguo1, DING Li1, ZHANG Lijun1, LUAN Chonglin1, YU Huahong2

（1. Shenzhen Polytechnic，Shenzhen Public Technology Service Platform for Scale Cell Culture Techniques and Cell Resource，Shenzhen,Guangdong 518055, China; 2. Department of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330031, China）

杜氏盐藻与4 种海洋微藻间的化感作用*

潘远健1，2，金刚*1，代建国1，丁莉1，张丽君1，栾崇林1，于化泓2

利用交叉培养结合高效液相色谱分析的方法，研究了杜氏盐藻与球等鞭金藻、叉鞭金藻、湛江等鞭金藻和小球藻之间的化感作用，并测定了受试后球等鞭金藻和杜氏盐藻的SOD活力．结果表明：（1）杜氏盐藻与球等鞭金藻、青岛叉鞭金藻、湛江等鞭金藻及小球藻之间存在着显著的化感作用，其中，湛江等鞭金藻、青岛叉鞭金藻胞外滤液对杜氏盐藻的生长有明显的抑制作用，杜氏盐藻胞外滤液明显地抑制小球藻的生长；（2）青岛叉鞭金藻、湛江叉鞭金藻、球等鞭金藻和小球藻胞外滤液萃取物分别至少由6种、8 种、6 种和6种物质组成；（3）微藻胞外滤液对受试藻SOD酶活性有明显影响．

微藻；杜氏盐藻；化感作用

由水体富营养化导致的有害藻类暴发性生长，已成为一个世界性的环境问题[1]．传统的藻类控制方法主要有化学、物理和微生物抑藻、动物捕食等．这些方法都不同程度地存在缺陷，如产生次二次污染、费用高等．而藻类的化感作用为解决上述问题提供了一种新颖的思路．化感作用是物种之间的基本生态关系之一，通过分泌至周围环境的化感物质来调节物种的数量或者产生其它生态效应．化感物质通常是植物生长过程中产生的次级代谢物，它们对藻类的化感作用专一性较好，并且一般都能在自然条件下降解[2]．因此，植物化感作用控藻方法是一种生态安全性好，有良好的应用前景的方法．已有较多研究涉及陆生植物和大型水生植物的提取物对藻类生长的控制效果．例如 Nakai 等研究表明，水生植物可以通过连续释放化感物质来抑制藻类的生长[3]．但是，微藻之间的化感作用报道还不多．

本实验以微藻的胞外滤液作为基础实验用液，运用交叉培养的方法[4]，探讨分析了球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、叉鞭金藻(Dicrateria inornata)、湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis Hu. Var. sp)以及小球藻（Chlorella vulgaris）与杜氏盐藻（Dunaliella salina）间的化感作用，同时通过测定受试藻的SOD活力和高效液相色谱分析球等鞭金藻等4种海洋微藻胞外滤液的萃取物，以期获知胞外滤液中化感物质的相关信息，为利用化感作用原理应用于经济微藻的生产和水体富营养化的治理提供有价值的参考．

1 材料和方法

1.1 藻种

杜氏盐藻、球等鞭金藻、叉鞭金藻、湛江等鞭金藻和小球藻为本实验室保存，经传代培养后作为实验材料．

1.2 主要仪器和试剂

Spectra Max M2酶标仪（北京九宇鑫泰生物技术有限公司），高效液相色谱仪（深圳宝域科技有限公司），净化工作台（蚌埠净化设备厂），280高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂），微量移液枪，小型离心机，SOD活力测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）．

1.3 微藻胞外滤液的制备

采用PES培养液培养微藻，盐度为30.5‰，培养温度为（25±1）℃．培养液所用海水为人工配制海水，高温灭菌冷却后待用．所用试验器皿先经浸泡，烘干，高压灭菌，冷却后使用．试验操作均在超净工作台无菌条件下进行．培养液体积为150 mL．培养条件：光照强度3000 Lux，光暗周期12 L：12 D．每天摇动培养瓶3次并随机调换摆放位置，以防止藻细胞附壁沉淀和减少光照误差．

微藻胞外滤液的收集方法：培养 15 d 后，将生长至衰退期的供体藻离心收集其藻液，用灭菌人工海水(盐度为30.5‰)离心洗涤l-2次．再往无菌藻体中加入50 mL的无菌人工海水，混匀，置于光照培养架中浸提．3d后离心收集上清液．上清液需多次离心直至上清中镜检不出藻体，再用无菌0.22 μm微孔滤膜过滤一次，以完全去除藻体．所得上清液即为微藻胞外滤液，储存于4 ℃保存备用．

1.4 微藻在胞外滤液中的培养

1.4.1 杜氏盐藻在4种海洋微藻胞外滤液中的培养

将4种微藻胞外滤液按不同体积比分别加入PES培养基，体积比分别为 0、20%、40%、60%、80%，各配制100 mL，分别接种6×105/ mL的杜氏盐藻，置于组培架培养，温度 25℃，光照强度3000 Lux，光暗周期为12 L：12 D，每个培养瓶设定3 个平行样．

1.4.2 微藻的胞外滤液萃取物的制备以及萃取物对杜氏盐藻生长的影响

将4 种微藻胞外液各 100 mL pH调至2.5，用乙酸乙酯萃取，50 ℃蒸干后，将萃取物分别加入100 mL PES培养基中，均用于培养杜氏盐藻，接种密度为 6×105/mL ．培养条件同1.4.1．

1.5 SOD酶活力的测定

分别取球等鞭金藻和小球藻0～60%体积比胞外滤液作用后盐藻的待测藻液40 mL，6000 r/min离心5 min，倾去上清夜，加入5 mL的0.1mol/L的磷酸钠缓冲液(pH7.0)混匀，6000 r/min离心5 min，重复洗涤一次．再离心后得到的藻体当中加入5mL磷酸钠缓冲液(pH.70)．在冰水浴条件下用超声波细胞破碎机600W 破碎5min，再于4000 r/min离心10 min，上清液即为超氧化物歧化酶SOD粗酶液，用于SOD活力的测定．

SOD活性按试剂盒说明测定．

1.6 微藻胞外滤液萃取物的高效液相色谱分析

取适量微藻胞外滤液萃取物，用乙酸乙酯溶解后，进行高效液相色谱分析．色谱条件：流动相为乙腈-水（体积比为70:30）；色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-Cl8，ID 4.6 mm×150 mm，5 µm；0.3 mL / min恒流洗脱；检测波长：UV-235 nm，进样量10µL．

2 结果

2.1 四种海洋微藻胞外滤液对杜氏盐藻生长的影响

通过测量藻细胞的光密度值，依据光密度值与细胞密度之间的关系，可简便快捷地得知微藻的生长情况[5,6]．图1显示了杜氏盐藻在4种海洋微藻胞外滤液不同体积比混合液中的生长曲线．从图1可以看出，当湛江等鞭金藻、叉鞭金藻胞外滤液体积比大于20%时，对杜氏盐藻的生长都有明显的抑制作用，并且这种抑制作用随胞外滤液体积比的增大而加强．球等鞭金藻胞外滤液体积比较低时，明显促进杜氏盐藻生长，而体积比大于60%时，抑制了杜氏盐藻的生长．小球藻胞外滤液体积比在0～20%时，对杜氏盐藻的生长起促进作用，而体积比大于20%时则抑制杜氏盐藻的生长．

2.2 杜氏盐藻胞外滤液对四种海洋微藻生长的影响

由图 2可以看出，杜氏盐藻胞外滤液明显地抑制了小球藻的生长，并且随胞外滤液比例的增大对小球藻生长的抑制作用更加明显．然而，当胞外滤液体积比大于20% 时，杜氏盐藻胞外滤液明显地促进了球等鞭金藻的生长．杜氏盐藻胞外滤液对叉鞭金藻和湛江等鞭金藻的影响有所不同，当滤液体积比在 20%～40%范围时，杜氏盐藻胞外滤液促进了叉鞭金藻的生长，当滤液体积比在 20%～60%范围内，杜氏盐藻胞外滤液明显地促进湛江等鞭金藻的生长，仅当胞外滤液体积比大于80% 时对其生长才呈现抑制作用．

2.3 微藻的胞外滤液萃取物对杜氏盐藻生长的影响

4种海洋微藻胞外滤液的萃取物对杜氏盐藻生长的影响结果如图3所示．除了球等鞭金藻的胞外滤液萃取物可以促进杜氏盐藻的生长以外，其余均抑制杜氏盐藻的生长，且抑制作用类似于它们各自的胞外滤液对杜氏盐藻生长的抑制效果．

2.4 SOD酶活性

SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，它可以清除自由基，使细胞免受伤害，能够使植物在一定程度上忍耐、减缓或抵抗逆境胁迫．有研究发现，芦苇中分离得到的抑藻活性组分能够降低藻细胞中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性，引起某些脂类的过氧化①Li F M, Hu H Y. Isolation and characterization of a novel antialgal allelochemical from Phragmites communis[J]. Applied and Environmental Microbiology, (in press).．SOD酶活性越高，其抵抗力越强[7]．

球等鞭金藻和小球藻胞外滤液体积比在0～60%范围内，对杜氏盐藻SOD活性的影响分别如图4和图5所示．从图4可以看出，在球等鞭金藻胞外滤液对杜氏盐藻的作用中，40%的胞外滤液SOD活性最大，说明藻体内抗氧化系统得到了增强，SOD活性上升，以清除体内产生的过量的自由基，进而减轻藻体所受到的伤害，提高其抵抗力和促进细胞增殖．在图5中，小球藻藻胞外滤液体积比为20%时，杜氏盐藻SOD活性最高，随后逐渐降低，表明细胞液中自由基由少变多，机体内受到了一定的伤害，从而抑制细胞增殖．

图1 4种微藻胞外滤液对杜氏盐藻生长的影响

图2 杜氏盐藻胞外滤液对4中微藻生长的影响

图3 微藻胞外滤液萃取物对杜氏盐藻的生长的影响

图4 杜氏盐藻胞外滤液对球等鞭金藻SOD活力的影响

图5 小球藻胞外滤液对杜氏盐藻SOD活力的影响

图6 4种微藻胞外滤液物质组成液相色谱图

2.5 微藻的胞外滤液萃取物的高效液相色谱分析结果

利用高效液相色谱分析了4 种海洋微藻胞外滤液萃取物的成分（图6）．青岛叉鞭金藻胞外滤液萃取物产生6个主要峰（图6a），出现时间分别为6.768，8.013，9.846，10.630，12.924，26.017 min．湛江叉鞭金藻胞外滤液萃取物产生8个主要峰（图6b），出现时间分别为4.950，6.814，8.051，8.905，9.832，10.814，12.939，25.650 min．球等鞭金藻胞外滤液萃取物产生6个主要峰（图6c），出现时间分别为6.825，8.045，9.830，10.814，12.924，25.606 min．小球藻胞外滤液萃取物产生6个主要峰（图6d），出现时间分别为6.817，8.078，9.821，10.798，12.898，25.564min．由此可知，叉鞭金藻，湛江叉鞭金藻，球等鞭金藻和小球藻胞外滤液萃取物分别至少由6种、8 种、6 种和6种物质组成．这些物质的具体化学信息还有待进一步研究．

3 讨论

化感效应包括3种类型：抑制效应、促进效应和中性效应[8]．目前，已经有相关文献报道了雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）[9]、中肋骨条藻（Skeletonema costatum）[10]、强壮前沟藻（Amphidinum carterae Hulburt）、青岛大扁藻（Platymonas helgolondica var.tsingtaoensis）[11]和某些赤潮微藻[12,13]等微藻的化感作用．本研究利用交叉培养方法确定了杜氏盐藻与球等鞭金藻、叉鞭金藻、湛江等鞭金藻和小球藻之间存在着显著的化感作用（图1和图2）．其中，球等鞭金藻、杜氏盐藻胞外滤液对彼此之间的生长起相互促进作用．而湛江等鞭金藻和叉鞭金藻胞外滤液对杜氏盐藻，以及杜氏盐藻胞外滤液对小球藻的抑制作用则比较显著，说明同一种藻对不同的受体藻会产生多种的化感效应类型．杜氏盐藻与湛江等鞭金藻的相互化感效应类型不同，其中湛江等鞭金藻胞外滤液对杜氏盐藻的生长产生促进作用，而杜氏盐藻胞外滤液对湛江等鞭金藻的生长则产生抑制作用．

本研究结果显示，在所选5种海洋微藻中，叉鞭金藻、湛江等鞭金藻和小球藻的胞外滤液的乙酸乙酯萃取物能明显抑制杜氏盐藻的生长，球等鞭金藻的胞外滤液的乙酸乙酯萃取物则能促进杜氏盐藻的生长．因此，这不仅证明杜氏盐藻与球等鞭金藻等4种海洋微藻间存在着显著的化感作用，同时也说明这4种海洋微藻胞外滤液中的化感物质可以通过有机溶剂提取获得．其它研究也有类似结果[1]．本研究还发现，受杜氏盐藻各个体积比胞外滤液作用的球等鞭金藻SOD酶活性均显著高于对照组，可能的原因是其SOD酶活性足以保护其免受伤害，使生物量免遭不利影响，该藻的抗逆性得到加强，提高了机体的生理生化机制，从而加快藻细胞的生长繁殖速度．杜氏盐藻SOD活力在高浓度（60%）的小球藻胞外滤液作用下低于对照组，SOD酶的平衡遭受破坏且新的平衡难以重新建立，从而导致细胞受到损伤，其细胞密度和生物量的增长受到抑制．因此笔者认为，微藻生长环境发生改变时，SOD酶活性间接的体现了受体藻的促进和抑制效应类型，即受体藻SOD酶活性高，滤液对其生长会产生促进作用，活性低则反之，二者间很可能存在某种线性关系．

通过高效液相谱法（HPLC）较好地分离出小球藻，叉鞭金藻，球等鞭金藻和湛江等鞭金藻的胞外滤液萃取物的成分．由图6可知，这些微藻滤液中存在着数量不等和种类不同的化感物质．杜氏盐藻和球等鞭金藻均为营养价值和经济价值较高的微藻，两者之间的胞外滤液可以相互促进彼此的生长，同时杜氏盐藻胞外滤液还可以对小球藻产生抑制作用，为利用化感作用原理应用于经济微藻的生产和水体富营养化的治理上提供一定参考．

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Allelopathy Between Dunaliella Salina and Four Species of Marine Microalgae

Together with high performance liquid chromatography (HPLC) analysis, the method of cross culture is applied to research the allelopathy among the Dunaliella salina, Isochrysis galbana, Dicrateria inornata, Isochrysis zhangjiangensis and Chlorella vulgaris. Besides, the SOD activity of I. galbana and D. salina is measured. Results indicate that: ① a significant allelopathy exists among the D. salina, I. galbana, D. inornata, I. zhangjiangensis and C. vulgaris, in which the extracellular filtrate of Isochrysis zhangjiangensis and Dicrateria inornata distinctively inhibits the growth of D. salina; the extracellular filtrate of D. salina inhibits the growth of C. vulgaris. ② The extracellular filtrate of D. inornata, I. zhangjiangensis, I. galbana and C. vulgaris respectively consists of at least 6, 8, 6, 6 kinds of components; ③ The extracellular filtrate has obvious influence on the SOD enzyme activity of the subjected algae.

marine microalgae; Dunaliella salina; allelopathy

PAN Yuanjian1，2, JIN Gang1, DAI Jianguo1, DING Li1, ZHANG Lijun1, LUAN Chonglin1, YU Huahong2

Q178.532

1672-0318（2015）03-0047-07

10.13899/j.cnki.szptxb.2015.03.011

2014-07-10

*项目来源：深圳市科技项目（JC201005280534A，JCY20130331151022276）；广东省自然科学基金资助项目（10151805501000007）

潘远健 (1987-)，男，汉族，广西梧州人，硕士研究生，主要从事生物学研究．

*通讯作者：金刚，教授，E-mail：jingang@szpt.edu.cn．