响应面法优化假丝酵母Y6产γ-氨基丁酸发酵工艺

郑鸿雁，赵炜彤，昌妍希

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010100）

响应面法优化假丝酵母Y6产γ-氨基丁酸发酵工艺

郑鸿雁1，赵炜彤1，昌妍希2

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010100）

从火龙果果实表面上筛选出一株发酵产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）假丝酵母菌菌株Y6（Candida sp.）。用反相高效液相色谱测定发酵液中GABA含量。响应面试验确定其最适培养基成分为：蔗糖23 g/L、麸皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L。最适培养条件为初始 pH 4.5、培养温度28 ℃、转速200 r/min、培养时间3.5 d。结果表明：优化之后GABA的产量提高了72%。

γ-氨基丁酸；假丝酵母；响应面法；培养基成分

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又称氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，分布非常广泛[1]，在动物[2]、植物和微生物中均有γ-氨基丁酸存在[3-6]。GABA是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质[7]，具有许多重要的生理功能，如降血压[8]、安定神经[9]、增强记忆[10]、抗焦虑[11]，尤其对更年期的失眠、压抑和自身失调疗效良好[12]。随着GABA的生理功能不断研究和阐明[13]，已经发展成为一种新型的功能性因子[14]，正逐渐应用于医药、食品及农业等行业中[15-17]。目前GABA主要通过微生物发酵方法进行生产[18]，大肠杆菌是发现较早的具有谷氨酸脱羧酶活性的微生物，利用大肠杆菌发酵法制备的GABA一般用于化工生产，很少用于食品工业，因此制约了GABA的生产和开发[19]。本研究以筛选自火龙果果实表面的假丝酵母菌株Y6为研究对象，通过单因素试验和响应面法对其产GABA进行发酵工艺条件优化，提高GABA产量。用麸皮作为发酵培养基中的氮源，为规模化利用廉价农副产品生产保健品奠定了基础，对于GABA的发酵生产具有参考意义。总之，国内学者的研究工作主要集中在筛选高产GABA的菌株上，但是其规模化生产的成本太高，因此降低γ-氨基丁酸的发酵培养成本是限制我国生产γ-氨基丁酸的瓶颈问题，突破该瓶颈势在必行。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基与试剂

假丝酵母（Candida sp.）Y6：分离自火龙果果实表面，购于长春市欧亚超市。菌种经生工生物工程（上海）股份有限公司分子生物学鉴定。

基础发酵培养基：葡萄糖30 g、麸皮40 g、L-谷氨酸5 g、磷酸吡哆醛0.12 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸馏水1 000 mL。

γ-氨基丁酸标准品 上海楷洋生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Z-36HK高速低温冷冻离心机 德国Hermle公司；DL-CJ-2N超级洁净工作台、空气浴振荡箱 北京东联哈尔仪器制造有限公司；Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪（SPD-20A紫外检测器，LC-20AT泵，CTO-10AS VP柱温箱，LC-solution工作站） 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株Y6发酵基础培养条件

按2%的接种量接种在装有100 mL无菌发酵培养基（初始pH 6.0）的250 mL三角瓶中，26 ℃、200 r/min条件下恒温旋转培养2.0 d。

1.3.2 GABA含量的测定

用邻苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）柱前衍生紫外检测反相高效液相色谱（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法测定发酵液中GABA含量。液相色谱条件：色谱柱：Venusil-AA氨基酸分析专用柱（5 μm）。流动相：流动相A为25 mmol/L的乙酸钠，用4%的乙酸调pH值至5.9；流动相B为纯乙腈。流速为1 mL/min，梯度洗脱程序如表1所示，柱温40 ℃，进样量20 μL，检测波长：332 nm。取发酵液5 000 r/min离心15 min取上清液，稀释到一定浓度。发酵液20 μL于样品瓶中，加入OPA衍生液100 μL，涡旋振荡5 s，静置2 min后，过0.45 μm滤膜，取20 μL进样。定量采用GABA标准曲线，取0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL GABA标准溶液分别邻苯二甲醛衍生后进行液相色谱测定。以色谱图中峰面积为纵坐标，以待测样品质量浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，回归方程为y=8.9×107x＋1 155.9（R2=0.999 8）。采用RP-HPLC检测GABA所得的峰面积，根据标准曲线换算成GABA产量。

表1 梯度洗脱程序表Table 1 Gradient elution program

1.3.3 发酵培养基优化

1.3.3.1 单因素试验

选择不同碳源、碳源质量浓度、麸皮添加量、L-谷氨酸和磷酸吡哆醛作为影响假丝酵母Y6产GABA发酵培养基的主要因素。不同碳源种类有葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖（30 g/L)，选取最适碳源进行发酵试验。各因素的水平梯度设置分别为最适碳源质量浓度15、20、25、30、35 g/L，麸皮添加量40、50、65、70、80 g/L，L-谷氨酸3、4、5、6、7、8、9 g/L，磷酸吡哆醛0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L。

1.3.3.2 响应面法优化培养基

根据单因素试验结果，选取蔗糖质量浓度、麸皮添加量、L-谷氨酸添加量、磷酸吡哆醛添加量4 个因素为自变量，单因素试验得出的各最佳条件为中心点，以GABA为响应值，进行响应面试验设计，确定发酵培养基最优培养基组分含量。每个试验重复3 次，取其平均值。

1.3.4 发酵条件优化

1.3.4.1 单因素试验

选择初始pH值、培养温度、摇床转速、培养时间作为影响假丝酵母Y6产GABA发酵条件的主要因素，通过单因素试验结果选取响应面试验的因素和水平。各因素的水平梯度设置分别为时间2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 d，温度22、24、26、28、30、32、34 ℃，初始pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，摇床转速120、140、160、180、200、220 r/min。

1.3.4.2 响应面法优化培养条件

根据单因素试验结果，选取初始pH值、培养温度、摇床转速、培养时间4 个因素为自变量，单因素试验得出的各最佳条件为中心点，以GABA为响应值，进行响应面试验设计，确定最优发酵条件。每个试验重复3 次，取其平均值。

1.3.5 模型验证

通过响应面法优化假丝酵母菌Y6产GABA发酵条件进行发酵试验，比较模型预测值和试验值，验证模型的有效性。

1.4 数据分析

采用Design Expert 7.0软件设计四因素三水平响应面分析试验，试验结果采用Design Expert 7.0软件进行数据处理和分析，确定最佳试验条件。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的确定

2.1.1 培养基单因素试验结果

图1 培养基对GABA产量的影响Fig.1 Effect of medium components on GABA production

由图1a可知，不同的碳源种类对GABA产量有差异，以蔗糖作为发酵培养基碳源时，GABA产量明显高于其他碳源，所以把蔗糖选作最适碳源。在确定碳源种类的基础上，进一步确定蔗糖质量浓度大小，由图1b可知，随着蔗糖质量浓度的增大，GABA产量增加，当蔗糖质量浓度为25 g/L时，GABA产量达到最大。但随着蔗糖质量浓度继续增大，GABA产量降低，分析原因有可能是碳源质量浓度过大，会使菌体大量繁殖，影响GABA的积累。L-谷氨酸脱羧后生成GABA，可作为其前体物，由图1c可知，随着L-谷氨酸的增加，GABA产量迅速增大，当L-谷氨酸质量浓度为6 g/L时，GABA产量达到3.100 g/L，但继续增加L-谷氨酸，GABA产量没有明显增大，可能是因为L-谷氨酸转化率已经达到最大。麸皮是廉价农副产品，把它作为培养基的氮源，可以降低成产成本，增大麸皮的利用价值，由图1d可知，随着麸皮添加量的增大，GABA产量增加，麸皮添加量在60 g/L时，GABA产量最高，在麸皮超过60 g/L时，GABA产量略有降低，磷酸吡哆醛是谷氨酸脱羧酶的辅酶，在发酵培养基加入它有促进谷氨酸脱羧酶的作用，由图1e可知，磷酸吡哆醛的最佳浓度为0.5 mmol/L。

2.1.2 培养基响应面优化

表2 发酵培养基响应面试验设计及结果Table 2 Response surface central composite design and experimental results for the optimization of medium components

表3 发酵培养基回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model for medium components

由方差分析得出P值，模型极显著，模型的失拟项不显著，回归决定系数R2=0.950 4，修正决定系数= 0.900 7，说明方程拟合性较好，可以应用于对培养基优化的分析预测。根据结果进行分析：一次项X1、X4显著，X2极显著，二次项极显著，交叉项X1X2显著，X1X4、X2X3极显著。由表3可知，影响GABA产量的因素大小排序依次是麸皮质量浓度、蔗糖质量浓度、磷酸吡哆醛浓度、L-谷氨酸质量浓度。

图2 培养基交互因素响应面图及等高线图Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of medium components on GABA production

发酵培养基交互因素响应面立体分析见图2。数据分析表明回归模型存在最大值，发酵培养基最优配方为：蔗糖23 g/L、麸皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L，此条件下理论预测最大值为3.453 g/L。验证实验此条件下GABA产量为3.450 g/L，基本与预测值一致，证明了模型的可靠性。

2.2 发酵培养最适条件的确定

2.2.1 发酵条件单因素试验结果

图3 发酵培养条件对GABA产量的影响Fig.3 Effect of fermentation conditions on GABA production

由图3a可知，发酵培养基初始pH值在4.0～5.0的范围内，GABA产量在增大，当pH值大于5.0时，GABA产量明显下降，表明培养假丝酵母Y6的最适pH值在5.0附近。由图3b可知，温度为28 ℃，GABA产量最高，低于或高于28 ℃，都不利于菌株产GABA，说明28 ℃左右是假丝酵母Y6产GABA较为适宜的温度。由图3c可知，摇床转速从120 r/min增加到200 r/min的过程中，GABA产量不断增大，在转速高达220 r/min时，GABA产量略有降低。由图3d可知，在发酵时间为2.0 d时，GABA产量为2.500 g/L，随着发酵时间的延长，GABA产量逐渐增加。发酵时间在3.5 d时达最高，为4.100 g/L。但多于3.5 d时，GABA产量略有减少，选择3.5 d为发酵培养时间。

2.2.2 发酵条件响应面优化

表4 发酵条件响应面试验设计及结果Table 4 Response surface central composite design and experimental results for the optimization of fermentation conditions

表5 发酵条件回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model for fermentation conditions

试验方案及试验结果见表4，回归分析见表5。根据试验结果，利用响应面分析软件对数据进行分析，以GABA产量为响应值，得到回归方程表达为：

由方差分析得出P值，模型极显著，模型的失拟性不显著，回归决定系数R2=0.955 9，修正决定系数说明方程拟合性较好，可以应用于对发酵条件优化的分析预测。根据结果进行分析：一次项X1极显著，二次项极显著，交叉项极显著。由表5可知，影响GABA产量的因素由大到小排序依次是初始pH值、培养温度、摇床转速、培养时间。

图4 发酵条件交互因素响应面图Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of fermentation conditions on GABA production

发酵条件交互因素响应面立体分析见图4。数据分析表明回归模型存在最大值，发酵最优条件为：初始pH 4.5、培养温度28 ℃、转速200 r/min、培养时间3.5 d，此条件下理论预测最大值为4.333 g/L。进行验证实验，此条件下GABA产量为4.300 g/L，基本与预测值一致。

与采用其他氮源发酵生产GABA相比，利用麸皮作为氮源突破发酵成本高的缺陷，降低其生产成本，增加麸皮及农副产品的附加值，实现农副产品环境友好的高附加值转化，在实际应用中具有更加广阔的发展空间。除酵母菌外，含有谷氨酸脱羧酶的大肠杆菌、霉菌、乳酸菌等也可用于GABA的生产[20]。罗少华等[21]以明胶为载体，戊二醛为交联剂，采用包埋-交联复合固载法固定大肠杆菌细胞用于制备γ-氨基丁酸，虽然具有较高的转化率，但安全性较差。边鑫等[22]利用突变株米曲霉3.800接入大豆-水的培养基中发酵产GABA为0.874 g/L。江南大学黄桂东等[23]从黄酒发酵过程中分离得到的一株具有产GABA能力的植物乳杆菌MJ0301进行了发酵培养基的优化，产量为1.590 g/L。本实验在发酵培养基中添加了辅酶磷酸吡哆醛，并且通过响应面优化了发酵培养基组分及发酵条件，有效地提高了发酵GABA的产量，最终GABA产量高达4.300 g/L。

3 结 论

本研究通过单因素试验和响应面试验方法，以GABA产量为指标，采用反相高效液相色谱邻苯二甲醛柱前衍生法对发酵液中GABA含量进行测定，优化了假丝酵母菌Y6产GABA发酵培养基及其发酵条件。确定了假丝酵母Y6发酵产GABA的最优培养基配方：蔗糖23 g/L、麸皮65 g/L、L-谷氨酸6 g/L、磷酸吡哆醛0.5 mmol/L，最适发酵条件：初始 pH 4.5、培养温度28 ℃、转速200 r/min、培养时间3.5 d。在此条件下，GABA产量达4.300 g/L，较优化之前的2.500 g/L提高了72%。用响应面法优化假丝酵母Y6产GABA的发酵工艺条件是有效可行的。然而产量提高与多种因素有关，除了对菌种发酵条件的优化以外，利用现代分子生物技术改变GAD的酶活性来提高产γ-氨基丁酸的产量有待进一步研究。

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Optimization of Medium Components and Culture Conditions for Enhanced Yield of γ-Aminobutyric Acid by Candida sp. Y6 by Response Surface Methodology

ZHENG Hongyan1， ZHAO Weitong1， CHANG Yanxi2
(1. College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2. Pharmacy College， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010100， China)

In this study， we optimized medium components and culture conditions of Candida sp. Y6， a γ-aminobutyric acid (GABA)-producing strain isolated from the surface of pitaya， using response surface methodology (RSM). The content of GABA in fermentation broth was analyzed by reversed phase high performance chromatography (RP-HPLC). The optimal fermentation medium was found to consist of 23 g/L sucrose， 65 g/L wheat bran， 6 g/L L-glutamate， and 0.5 mmol/L pyridoxal phosphate， and the optimal culture conditions were initial medium pH 4.5 and 28 ℃ for 3.5 d with a shaking speed of 200 r/min. Under the optimal conditions， the yield of GABA was increased 72% when compared with that before optimization.

γ-aminobutyric acid; Candida sp.; response surface methodology; medium components

TS201.3

A

1002-6630（2015）09-0130-06

10.7506/spkx1002-6630-201509024

2014-07-29

郑鸿雁（1968—），女，副教授，硕士，研究方向为功能食品、微生物菌种筛选及发酵工艺。E-mail：zhenghongyan6811@163.com