超声波辅助 消化-石墨炉原子吸收法快速测定海参中总钒和有机钒含量

刘炎峻，徐 杰，周庆新，薛 勇，薛长湖*，王静凤

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

超声波辅助 消化-石墨炉原子吸收法快速测定海参中总钒和有机钒含量

刘炎峻，徐 杰，周庆新，薛 勇，薛长湖*，王静凤

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）

建立超声波辅助消化-石墨炉原子吸收法快速测定海参中钒元素的方法。通过单因素试验和正交试验选择适宜超声波消化时间30 min与超声波水浴温度60 ℃，以及最佳的原子吸收条件（灰化温度900 ℃、原子化温度2 700 ℃、灰化时间20 s、原子化时间5 s），实现了海参样品的快速消化，使金属元素快速释放，并成功应用到海参中钒含量的测定。方法加标回收率在94.2%～105.4%之间，检出限为1.44×10－3μg/mL，符合测定要求。在选定的工作条件下测定，结果表明中国南北方产地的仿刺参总钒和有机钒含量分别为0.27～1.43 μg/g和0.22～1.08 μg/g，具有明显的差异性，并且60.4%～85.7%的钒以有机钒形式存在。14 种海参的有机钒分析发现，糙海参有机钒含量最高，达2.56 μg/g。海参中的总钒及其有机钒含量受品种、采样地点和环境的影响。超声波辅助消化-原子吸收法测定海参中钒元素快速、稳定，具有较高的实用价值。

钒；海参；有机化程度；超声波辅助消化-石墨炉原子吸收光谱法

钒是人体及其他动物必需的一种微量元素，具有多种生物学功能。1980年Schecher等[1]首先发现VO2＋有很好的类胰岛素活性，使钒化合物开始作为一个潜在的药物而受到关注[2]，同时近年来不断证明无机钒盐以及钒配合物均具有明显的降血糖作用[3-4]。生物体中含量较少，但是几乎所有动物体内都可以证实钒的存在，而海产品的含钒量最高[1]，尤其是大量食沉积物的底栖动物，如棘皮动物的海参类、海鞘类等[5]。

海参是棘皮动物门海参纲动物的统称，海参纲约有900多个种类，全部生活在海洋中，世界上可以食用的海参有40 种左右，如海参属（Holothuria）、刺参属（Stichopus）等。海参高蛋白质，低脂肪，不含胆固醇，富含多种氨基酸、维生素和锌、铁、硒等人体普遍缺乏的多种微量元素[6]。刘小芳等[7]采用电感耦合-等离子体原子发射光谱（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES）法分析表明，海参体壁钒含量3.51 mg/kg，而内脏中可达18.48 mg/kg，约为体壁钒含量的5 倍，经过对比海参所含有的钒，属诸食品之首，海参内脏钒的含量极高，在治疗糖尿病以及调节糖代谢和脂质代谢方面应有较好的研究价值。无机钒的生物活性低，而且难以吸收，因此具有物活性的有机钒是目前钒应用方面研究的热点。

测定钒的方法主要有分光光度法[8]、电位滴定法[9]、石墨炉原子吸收（graphite furnace atomic absorption spectrometry，GFAAS）法[10]、ICP-AES法等[11]。GFAAS法具有灵敏度高、需要样品量少、分析速度快、稳定性好等优点而被广泛用于微量元素的测定中[12]。消化食品传统的方法有干法灰化、湿法消化、高压消解和微波消解法等[13]，几种方法各有优劣，干法灰化前处理周期较长；湿法消化要用到大量硝酸、高氯酸等试剂；高压消解所需时间较长，而微波消解需要有专门的较昂贵的设备支持；超声波辅助消化（ultrasound-assisted digestion，UAD）的原理是当超声波施加到分散在液体介质中的细粉状固体时，超声波产生的空化效应就会促进提取，溶解和消化过程[14]。空化气泡在固-液界面塌陷的同时产生大量的能量并且释放，造成冲击波以及局部非常高的温度和压力，其导致的结果有：1）高压提高了溶剂的渗透性和运输；2）固体颗粒破碎，增大了与萃取剂的接触面积，提高萃取剂的浸出金属的能力[15]；3）促进氧化物质（如过氧化氢和羟自由基）的形成，协助有机物的氧化[16]。UAD的优点为条件温和（接近室温和大气压力下）、污染最小、试剂消耗低、消化时间极短[17-20]。由于海参含有较多复杂的有机和无机组分，并且干燥之后的海参样品结构紧密，传统的消解方式并不利于海参无机元素的释放，因此引入UAD用于海参样品钒的消化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采集产自大连獐子岛、烟台蓬莱、山东青岛、山东威海、辽宁盘锦、烟台牟平、福建霞浦、浙江温州的仿刺参干品各10 只（捕获时间2013年11月），另购买分属刺参科、海参科、瓜参科、蝶参科和尻参科的墨西哥等刺参、美国肉参、加州拟刺参、南非花刺参、梅花参、革皮氏海参、北极海参、糙海参、黄乳海参、白底辐肛参、图纹白尼参、北大西洋瓜参、长尾蝶参、白肛海地瓜14 种海参干品。

钒单元素标准溶液（1 000 μg/mL） 国家有色金属及电子材料分析测试中心；4-（2-吡啶偶氮）-间苯二酚、硝酸、高氯酸、过氧化氢（H2O2，30%）均为国产分析纯；透析袋（3.5 kD） 美国Sigma-Aldrich公司；所有玻璃器皿浸泡在25%的硝酸溶液24 h以上，用去离子水漂洗3 次，并储存在密封的容器中以避免污染。

1.2 仪器与设备

AA-6800F原子吸收分光光度计（配有GFA-EX7石墨炉原子化器、热解涂层石墨管和ASK-6100自动采样器）日本岛津公司；钒元素空心阴极灯 北京曙光明电子照明仪器有限公司；KQ-600KDE台式高功率数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HJ2双头加热磁力搅拌器 常州国华电器有限公司；ED36智能电热消解炉 莱伯泰科有限公司；ALPHA 1-4 LD plus冷冻干燥机 德国Christ公司；Unique-R20多功能超纯水系统上海力申科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超声波辅助消化条件

海参干粉（1.0 g）用15 mL硝酸-过氧化氢（4∶1，V/V）混合液浸渍于烧瓶中，密封后浸入超声波水浴中，60 ℃条件下超声处理30 min。冷却至室温后，4 000 r/min离心分离，将上清液转移到消解管中。接着通过使用电热消解炉80 ℃，10 min；100 ℃，10 min；160 ℃，10 min的加热条件进行赶酸消化以去除溶液中的氮氧化物、氟化物以及酸类。消化液用加入了0.1 mol/L乙二胺四乙酸的1% HCl溶液定容至10 mL，最后进行原子吸收测定，同时做样品空白溶液。

1.3.2 原子吸收条件

在整个加热程序中（除了雾化阶段），氩气以1.0 L/min的恒定流量被通入。20 μL空白溶液、标准溶液、样品空白和样品溶液通过自动进样器分别注入石墨管中并加热。为研究最佳的原子吸收条件，以山东威海仿刺参干粉为待测样品，取样量1.0 g，加标量40 ng/mL，以加标回收率为指标，对灰化温度、灰化时间、原子化温度、原子化时间，进行四因素三水平的正交试验。

1.3.3 方法验证

1.3.3.1 标准工作曲线的绘制

在上述优化后已确定的最佳消化和检测条件下，以1% HCl溶液为空白对照，利用钒单元素标准溶液（1 000 μg/mL）配制系列稀释钒标准溶液（0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 ng/mL），测定6 次其对应的吸光度，并对空白样品进行11 次的重复测定，绘制标准曲线。

1.3.3.2 回收率实验

为了验证结果的准确度，将海参样品分别加入不同量的标准品，进行加标回收实验，采用UAD-GFAAS法测定钒含量，分析其回收率。

1.3.4 样品处理

1.3.4.1 总钒样品液制备

每个海参样品设置6 个平行样（n=6），测定数据为6 次测定的平均值。用超纯水将海参体壁洗净，冷冻干燥，并利用粉碎机粉碎成干粉，用UAD-GFAAS法进行消化并测定总钒的含量。

1.3.4.2 有机钒样品液制备

参照Alzate等[21]的研究，将冷冻干燥，粉碎磨细后的海参体壁干粉（1.0 g）溶解于超纯水中，并转移到透析袋（截留分子质量3.5 kD），4 ℃条件下用超纯水透析48 h，每12 h更换透析外液。将透析后的海参溶液冷冻干燥至质量恒定，采用UAD-GFAAS法测定有机钒的含量。

1.3.4.3 海参钒的有机化程度计算

1.4 统计分析

正交试验的数据采用方差分析进行分析。正交试验结果通过SPSS 13.0软件进行数据分析，并计算K、k和R值。所有海参样品重复进行消化和分析3 次取平均值，含量结果以±s（n = 3）的方式给出。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助消化条件的选择

图1 超声波辅助消化时间的优化Fig.1 Optimization of ultrasound-assisted digestion time

为提高对样品的消化能力，在实验过程中加入硝酸与H2O2分别作为消化剂以及氧化剂[22]，硝酸-H2O2（4∶1，V/V）。以钒回收率为指标，利用单因素试验优化超声波浴的处理时间和水浴温度，结果见图1、2。UAD方法共需60 min。当超声时间达到30 min时，水浴温度达到60 ℃时，海参样品中的钒提取完全。水浴温度高达80 ℃时，会产生过多的泡沫，可能导致金属元素的挥发或损失，因此选择60 ℃作为合适的水浴温度。

图2 超声波辅助消化水浴温度的优化Fig.2 Optimization of ultrasound-assisted digestion temperature

2.2 原子吸收条件的正交试验优化

GFAAS分析方法中，灰化温度、灰化时间、原子化温度和原子化时间等工作参数，通常是影响定量检测最重要的因素[23]。采用L9（34）正交试验对石墨炉原子吸收的最佳条件进行优化。以钒的回收率作为因变量，正交试验的因素水平设计及结果见表1。

表1 正交试验设计及结果Table1 Orthogonal array design and results

由表1可知，原子化温度是影响钒定量测定的最重要因素，而影响钒定量检测的4 个因素顺序如下：C＞D＞A＞B。最适宜的石墨炉原子吸收工作条件A2B2C3D2即灰化温度900 ℃、灰化时间20 s、原子化温度2 800 ℃、原子化时间5s。然而，考虑到原子化温度2 700 ℃和2 800 ℃之间的差距，为了降低石墨管的消耗，最佳的工作条件为A2B2C2D2，即灰化温度900℃、灰化时间20 s、原子化温度2 700 ℃、原子化时间5 s。GFAAS的最佳工作条件为灯电流10.0 mA、波长318.4 nm、狭缝宽度0.5 nm、积分时间0.5 s、进样体积20 μL，控温程序见表2。

表2 石墨炉原子吸收控温工作条件Table2 Operating parameters of GFAAS

2.3 方法验证

2.3.1 标准工作曲线与精密度

在上述GFAAS最佳工作条件下，通过依次测定系列标准溶液（0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 ng/mL）的吸光度，从而得到标准工作曲线：A = 0.005 69x—0.001 42，R2= 0.999 7。从标准曲线可看出，在10～100 ng/mL的质量浓度范围内，吸光度与钒质量浓度之间呈线性相关，相对标准偏差为0.94%～4.35%，具有较好的相关性与稳定性。

2.3.2 检出限

经过对空白样品11 次的重复测定，Ãb= 0.008 4，标准偏差Sb为0.000 43，最小测量AL=Ãb＋KSb。取K = 3时，检出限为K × Sb/S = 1.44 × 10—3μg/mL；取K = 10时为定量限，定量限为K × Sb/S = 4.78 × 10—3μg/mL（Sb为空白标准偏差；S为工作曲线斜率）。

2.3.3 加标回收率

取海参样品进行超声波辅助消化并用GFAAS测定钒含量，对6 个样品分别加标测定，结果见表3。加标回收率均在94.2%～105.4%之间，表明本法符合测试要求。

表3 样品加标回收率结果Table3 Recoveries of vanadium from spiked samples

2.4 海参钒含量及其有机化程度分析

2.4.1 不同产地仿刺参的钒含量及其有机化程度分析

由于体壁是海参产品的主要可食部分，因此选取了中国不同产地冬季收获的仿刺参，并利用UAD-GFAAS法对其体壁的钒含量进行了测定。8 种不同产地仿刺参中的总钒含量、有机钒含量及有机化程度见表4。从总钒含量和有机钒含量来看，南北方有较大的差异，分别在0.27～1.43、0.22～1.08 μg/g之间波动，产自北方的大连獐子岛与烟台蓬莱的仿刺参总钒含量最高，分别达到1.43 μg/g和1.32 μg/g，有机钒含量同样最高，分别为1.08 μg/g和1.02 μg/g。与南方海域的仿刺参相比，北方海域的海参具有更高的钒含量，总钒量在0.91～1.43 μg/g之间，但差异不显著。同时，各产地仿刺参有机化程度在60.4%～85.7%之间，产自浙江温州的仿刺参有机化程度最高，达到85.7%，证明海参中钒主要以有机钒的形式存在。推测由于海参是一种底栖杂食性的海洋生物，主要以底质中的有机质、某些细菌和原生动物为食，海参在摄入无机态的钒后，大多数的钒会在体内进行生物转化，转化成有机形式。

表4 不同产地仿刺参的钒含量Table4 The contents of vanadium in sea cucumber Apostichopus opus japonicus icus from different regions ns

2.4.2 不同种类海参的有机钒含量分析

鉴于钒在海参中的主要存在形式是有机钒，因此对不同种类海参中的有机钒含量进行比较研究。墨西哥等刺参、美国肉参、加州拟刺参、南非花刺参、梅花参、革皮氏海参、北极海参、糙海参、黄乳海参、白底辐肛参、图纹白尼参、北大西洋瓜参、长尾蝶参、白肛海地瓜14 种海参的有机钒含量结果如表5所示。

由表5可见，海参科比刺参科、瓜参科、蝶参科、尻参科具有更高的有机钒含量，在0.8～2.56 μg/g之间，其中糙海参与图纹白尼参钒含量最高，分别达到2.56 μg/g和2.42 μg/g，而蝶参、梅花参、海地瓜有机钒含量最低，分别只有0.18、0.35、0.55 μg/g，海参大多生活在中纬度及低纬度海域，其中中纬度产海参中有机钒含量相比于低纬度海域产的海参要高，这可能由于中纬度海域气候及海水水质的差异导致。Abdel-Moati[24]、Anan[25]等分别研究了约40 种来自卡塔尔和里海海域的鱼类物种，阐明了钒含量具有类似的区域特点。从亚得里亚海海域不同采样点收获的贻贝，紫贻贝中也发现了钒含量的差异性（约0.5～7.5 μg/g）[26]。此后，Warnau等[27]发现，海参（Holothuria tubulosa）中的Ca、Fe等金属浓度受到器官、季节、环境因素影响。

表5 不同种类海参的有机钒含量Table 5 The contents of vanadium in different species of Table 5 The contents of vanadium in different species of sea cucumbers bers

3 结 论

实验研究了超声波辅助实现了海参样品的快速消化，过程简便、快速、成本低，同时四因素三水平的正交试验得到了最佳的石墨炉原子吸收工作条件。当超声波水浴60 ℃条件下消化30 min，可以达到金属元素的快速释放，同时在石墨炉灰化温度900 ℃、原子化温度2 700 ℃、灰化时间20 s和原子化时间5 s条件下，检出限为1.44×10－3μg/mL，并成功应用到海参中钒含量的测定。

分析8 种我国不同产地的仿刺参与14 种海参中钒含量的结果表明，海参中的钒含量受品种、采样地点和环境的影响，并且海参中60.4%～85.7%的钒是以有机形式存在。产自中国南北8 个产地的仿刺参总钒、有机钒含量分别在0.27～1.43、0.22～1.08 μg/g之间，南北方具有明显的差异性，同时海参中的钒主要以有机钒的形式存在。海参中的钒含量差异可能是由于周围的采样点的地质和水质特征或海参体内的累积机制差异导致。同时，由于海参中有机钒的存在，其存在形式、价态及降糖活性等值得深入研究。本实验正在调查更大的样本库以正确表征影响钒的生物利用度和钒在海参中的积累机制的生物和环境因素，本研究为之提供了快速有效的定量方法。

[1] 王夔. 生命科学中的微量元素[M]. 2版. 北京: 中国计量出版社, 1996: 145-171.

[2] NIELSEN F H. Metal ions in biological systems: vanadium and its role in life[M]. New York: Marcel Dekker, 1995: 543.

[3] 李杰, 邵明柏, 孔俭. 硫酸氧钒对糖尿病大鼠血糖和血脂的影响[J].南京医科大学学报: 自然科学版, 2003, 23(1): 48-50.

[4] 张小梅. 钒功能配合物的合成、结构及性质研究[D]. 北京: 首都师范大学, 2007: 9-10.

[5] MICHIBATA H, YAMAGUCHI N, UYAMA T, et al. Molecular biological approaches to the accumulation and reduction of vanadium by ascidians[J]. Coordination Chemistry Reviews, 2003, 237(1): 41-51.

[6] 樊绘曾. 海参: 海中人参: 关于海参及其成分保健医疗功能的研究与开发[J]. 中国海洋药物, 2001(4): 37-41.

[7] 刘小芳, 薛长湖, 王玉明, 等. 刺参中无机元素的聚类分析和主成分分析[J]. 光谱学与光谱分析, 2011(11): 3119-3122.

[8] TAYLOR M J C, van STADEN J F. Spectrophotometric determination of vanadium (Ⅳ) and vanadium (Ⅴ) in each other’s presence. review[J]. Analyst, 1994, 119(6): 1263-1276.

[9] 田波, 严川伟, 屈庆. 钒电池电解液的电位滴定分析[J]. 电池, 2003, 33(4): 261-263.

[10] 李建. 石墨炉原子吸收法测定保健食品中钒[J]. 中国食品卫生杂志, 2004, 16(5): 437-438.

[11] 张国文, 张涵. 茶叶中多种元素的ICP-AES测定[J]. 理化检验: 化学分册, 1997, 33(2): 63-65.

[12] 杨琳, 潘雷明, 周侃. 石墨炉原子吸收法测定罐头食品中的锡[J]. 食品科学, 2011, 32(6): 176-178.

[13] 杨雪娇, 黄伟, 林涛. 不同前处理方法检测食品中的重金属含量[J].现代食品科技, 2008, 24(10): 1051-1054.

[14] SORIA A C, VILLAMIEL M. Effect of ultrasound on the technological properties and bioactivity of food: a review[J]. Trends in Food Science and Technology, 2010, 21(7): 323-331.

[15] FILGUEIRAS A V, CAPELO J L, LAVILLA I, et al. Comparison of ultrasound-assisted extraction and microwave-assisted digestion for determination of magnesium, manganese and zinc in plant samples by flame atomic absorption spectrometry[J]. Talanta, 2000, 53(2): 433-441.

[16] TEIXEIRA L S, VIEIRA H P, WINDMOLLER C C, et al. Fast determination of trace elements in organic fertilizers using a cup-horn reactor for ultrasound-assisted extraction and fast sequential flame atomic absorption spectrometry[J]. Talanta, 2014, 119: 232-239.

[17] ALMERIDA T S, de ANDRADE R M, de GOIS J S, et al. Development of a simple and fast ultrasound-assisted extraction method for trace element determination in tobacco samples using ICPMS[J]. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 2014, 94(8): 756-764.

[18] LIMA ☒ C, BARBOSA F Jr., KRUG F J, et al. Comparison of ultrasound-assisted extraction, slurry sampling and microwaveassisted digestion for cadmium, copper and lead determination in biological and sediment samples by electrothermal atomic absorption spectrometry[J]. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2000, 15(8): 995-1000.

[19] ILANDER A, VAISANEN A. An ultrasound-assisted digestion method for the determination of toxic element concentrations in ash samples by inductively coupled plasma optical emission spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 602(2): 195-201.

[20] DOMINI C, VIDAL L, CRAVOTTO G, et al. A simultaneous, direct microwave/ultrasound-assisted digestion procedure for the determination of total Kjeldahl nitrogen[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2009, 16(4): 564-569.

[21] ALZATE A, CANAS B, PERZE-MUNGUIA S, et al. Evalution of the inorganic selenium biotransformation In selenium-enriched yogurt by HPLC/ICP-MS[J]. Agriculture Food Chemistry, 2007, 55(24): 9776-9783.

[22] ALMEIDA T S, de ANDRADE R M, de GOIS J S, et al. Development of a simple and fast ultrasound-assisted extraction method for trace element determination in tobacco samples using ICP-MS[J]. International Journal of Environmental Analytical Chemistry, 2014, 94(8): 756-764.

[23] 邓勃. 原子吸收光谱分析的原理, 技术和应用[M]. 北京: 清华大学出版社, 2004: 245-256.

[24] ABDEL-MOATI M. Bioaccumulation of chromium, nickel, lead and vanadium in some commercial fish and prawn from qatari waters[J]. Qatar University Science Journal, 1997, 17(1): 195-203.

[25] ANAN Y, KUNITO T, TANABE S, et al. Trace element accumulation in fishes collected from coastal waters of the Caspian Sea[J]. Marine Pollution Bulletin, 2005, 51(8): 882-888.

[26] FATTORINI D, NOTTI A, DI MENTO R, et al. Seasonal, spatial and inter-annual variations of trace metals in mussels from the Adriatic Sea: a regional gradient for arsenic and implica tions for monitoring the impact of off-shore activities[J]. Chemosphere, 2008, 72(10): 1524-1533.

[27] WARNAU M, DUTRIEUX S, LEDENT G, et al. Heavy metals in the sea cucumber Holothuria tubulosa (Echinodermata) from the Mediterranean Posidonia oceanica ecosystem: body compartment, seasonal, geographical and bathymetric variations[J]. Environmental Bioindicators, 2006, 1(4): 268-285.

Determination of Vanadium in Sea Cucumbers by Ultrasound-Assisted Digestion-Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry

LIU Yanjun, XU Jie, ZHOU Qingxin, XUE Yong, XUE Changhu*, WANG Jingfeng
(College of Food Science and Technology, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

A fast method for vanadium determination by ultrasound-assisted digestion-graphite furnace atomic absorption spectrometry (UAD-GFAAS) was proposed. Using single factor and L9(34) orthogonal array designs, the best digestion conditions (30 min, 60 ℃) influencing and the best GFAAS conditions (ashing at 900 ℃ for 20 s, atomization at 2 700 ℃for 5 s) were achieved. The UAD-GFAAS method could provide complete mineralization of the samples for vanadium determination in sea cucumber with a detection limit of 1.44 × 10-3μg/mL and acceptable analytical recovery of 94.2%–105.4% for vanadium. Values of 0.27–1.43 μg/g in terms of total vanadium and 0.22–1.08 μg/g in terms of organic vanadium were obtained in sea cucumbers from different sampling sites, suggesting a significant difference between North and South coastal habitats of China. The highest vanadium content (2.56 μg/g) in Holothuria scabra was determined among fourteen species of edible sea cucumber. Total vanadium and organic vanadium contents showed significant differences among different species and different sampling sites of sea cucumbers. Moreover, most vanadium exists in an organic form. Therefore, ultrasound-assisted digestion-graphite furnace atomic absorption spectrometry is a rapid, accurate and stable method, which has a high practical value.

vanadium; sea cucumber; organic degree; ultrasound-assisted digestion and graphite furnace atomic absorption spectrometry

TS254.1

A

1002-6630（2015）04-0126-05

10.7506/spkx1002-6630-201504024

2014-05-30

国家海洋公益性科研项目（201105029）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31201329）；长江学者创新团队发展计划资助项目（IRT1188）

刘炎峻（1991—），男，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：fs-lauyang@hotmail.com

*通信作者：薛长湖（1964—），男，教授，博士，研究方向为水产化学。E-mail：xuech@ouc.edu.cn