多孔水性聚氨酯表面接枝改性硫酸化壳聚糖复合膜的制备

王晓静，李国明 ，刘 聪，谢 胜，董玉雪

(华南师范大学化学与环境学院，广州510006)

聚氨酯是具有良好生物相容性和血液相容性的生物医用高分子材料，可用于制作组织工程化血液透析膜、心脏瓣膜和人工血管等［1］. 材料表面肝素化是提高水性聚氨酯血液相容性的经典方法［2］. 周素琼等［3－4］通过对壳聚糖进行定位硫酸酯化，得到6-O-硫酸酯化壳聚糖(6S-CS)，然后与水性聚氨酯(WPU)共混并以戊二醛作为交联剂，制得具有半互穿网络结构的WPU/6S-CS 复合膜，该复合膜具有较好的血液相容性.

但作为有效的细胞支架，仅有材料本身是不够的.组织工程的技术关键之一是将生物材料制成具有孔结构和特定形状的三维多孔支架［5］. 支架中孔的大小、形状和孔隙率等可直接影响组织细胞的迁移、增殖和分化［6］，这些因素随制备方法的不同而有很大变化.制备多孔支架常用的方法有纤维粘接、溶剂浇铸/粒子沥滤、气体发泡、相分离/冷冻干燥及快速成型等［7］. 其中，溶剂浇铸/粒子沥滤法可以通过控制致孔剂的颗粒大小以及致孔剂与聚合物材料的比例，从而控制多孔支架的孔尺寸、孔隙率及孔结构.这种方法常用的致孔剂粒子有氯化钠、柠檬酸钠和酒石酸钠等水溶性无机盐或糖粒子，以及冰粒子或石蜡粒子［8］. 由于这种方法制作简单，因而受到广泛的研究. Spaans 等［9］用氯化钠作致孔剂，制成了孔径为150～350 μm 的聚合物微孔膜.申雄军等［10］采用NaHCO3/Na2CO3作致孔剂，制成了大孔的尺寸范围为100～400 μm，支架的孔隙率高达94.8%.

本文制作支架的方法是从致孔剂沥滤法发展而来的，首先采用己二异氰酸酯三聚体(HT)等合成了水性聚氨酯(WPU)，并通过控制HT 的加入量，使WPU 膜保留一定含量的—NCO，与硫酸化壳聚糖(SCS)进行接枝反应. 在WPU 成膜过程中，选用碳酸钙(CaCO3)粒子作致孔剂，然后与盐酸反应，使其逸出气体，从而使WPU/SCS 复合膜形成微孔，制得多孔WPU/SCS 复合膜. 通过与盐酸反应，CaCO3粒子有助于聚合物泡孔的形成，比NaCl 致孔剂更容易被蒸馏水除去.

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

IR Prestiget-21 型红外光谱仪:SHIMADZU 公司;200PC 型示扫描量热分析:德国耐驰公司;50 型偏光显微镜:Nikon 公司;KZA 型温振荡水槽:上海森信实验仪器有限公司.

聚乙二醇800(PEG):分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司;己二异氰酸酯三聚体(HT)、2，4-甲苯二异氰酸酯(TDI):分析纯，天津市大茂化学试剂厂;1，4-丁二醇(BDO):分析纯，天津市福晨化学试剂厂;二羟甲基丙酸(DMPA):分析纯，阿拉丁;乙二胺(EDA):分析纯，江苏强盛化工有限公司;壳聚糖(CS):脱乙酰度91.18%，粘均分子量4.76 ×105，浙江玉环县海洋生物化学有限公司;浓硫酸:分析纯，衡阳市凯信化工试剂有限公司;三乙胺(TEA)、乙酸、无水乙醇、盐酸:分析纯，天津市大茂化学试剂厂.

1.2 水性聚氨酯的制备

在装有搅拌器、温度计和回流冷凝管的四口烧瓶中，加入5.0 g 聚乙二醇(平均摩尔质量800)、6.5 g TDI 和1.0 g HT 搅拌加热到60 ℃，滴加适量催化剂DBTL，并在80 ℃保温2 h.再滴加2.5 g BDO，保温30 min，然后加入0.6 g DMPA 在70℃反应2 h，降温至40 ℃加入0.5 g TEA 中和，然后加水进行高速乳化，同时用0.3 g EDA 扩链，即得到水性聚氨酯溶液.

1.3 硫酸化壳聚糖的制备

将0.5 g 壳聚糖、1.5%乙酸溶液20 mL 依次加入到三口烧瓶中，搅拌均匀后，加入一定量的浓H2SO4，在5 ℃左右的冰浴中反应一段时间后，升温到60 ℃反应一段时间，得到黏稠状浅黄色溶液，加入乙醇溶液使硫酸化壳聚糖沉淀析出，经过滤分离并用无水乙醇洗涤至中性，放入真空干燥箱中烘干，即得到硫酸化壳聚糖，转入干燥器中备用.

1.4 多孔水性聚氨酯表面接枝硫酸化壳聚糖复合膜的制备

称取一定量的水性聚氨酯于三口烧瓶中，然后加入一定量的致孔剂CaCO3(占WPU 质量的12%)，搅拌均匀，将产物滴在载玻片上流延成膜，室温风干静止一段时间，得水性聚氨酯薄膜.

将硫酸化壳聚糖溶于一定量的去离子水中制得5%的硫酸化壳聚糖溶液，称取一定量的水性聚氨酯薄膜(2 cm×2 cm)置于小烧杯中，然后加入一定量的硫酸化壳聚糖溶液，室温下浸泡24 h.取出薄膜，用蒸馏水冲洗3 遍，再将复合膜浸入5%的盐酸中，一定时间后取出，水洗至中性，并将薄膜置于60 ℃真空干燥箱中干燥，即制得多孔WPU/SCS 复合膜.

1.5 复合膜理化性能的测定

1.5.1 红外测试 将测试样品与KBr 混合、研磨、压片，测定范围4 000～500 cm－1.

1.5.2 表面显微观察 将复合膜置于载玻片上，用光学显微镜(200 倍)观察其表面形态.

1.5.3 孔隙率的测定 采用重量法［11］测定，具体操作如下:在恒温20 ℃条件下，将比重瓶装满乙醇后质量为W1;把质量为Ws的样品浸入乙醇中，脱气，务必使乙醇充盈于多孔材料的孔中，然后加满乙醇，称质量为W2;把浸满了乙醇的样品取出后，剩余的乙醇与比重瓶质量为W3.ρ 为测定温度下乙醇的密度.

样品本身体积:Vs=(W1－W2+Ws)/ρ，

样品孔体积:Vp=(W2－W3－ Ws)/ρ，

样品孔隙率:

1.5.4 吸水率的测定 从干燥脱水的PU 多孔膜上均匀剪取2 cm×2 cm 的样品，称取多孔膜在干态时的质量为W4，然后将多孔膜放在30 mL 蒸馏水中在37 ℃下浸泡24 h 后，小心取出，用滤纸吸干表面的水分，称其质量为W5，则多孔膜的吸水率按式(1)计算，将每个样测3 次，取其平均值.

1.5.5 扫描电镜观察 将复合膜置于盖玻片上，用扫描电镜(1 000 倍)观察其表面形态.

1.6 差示扫描量热法分析(DSC)

采用200PC 型热分析系统进行差示扫描量热法分析(DSC)，称取6 mg 左右样品加入到封盖的铝坩埚中，从173 K 开始升温，升温速度为10 K/min，气氛为氮气.

1.7 复合膜血液相容性的测试

1.7.1 复钙时间(PRT)实验 参照文献［12］，抽取新鲜兔血10 mL，以质量比9∶1 加入0.13 mol/L枸橼酸钠溶液，取全血5 mL，5 000 r/min 离心15 min，取上清血浆备用.

将膜剪成0.5 cm×0.5 cm 的小块薄膜，放入生理盐水中浸泡24 h，然后移至试管底部，每组3个平行样，分别取上清液0.1 mL 于该试管中，置于37 ℃恒温水浴30 s 后，加入0.025 mol/mL CaCl2溶液0.1 mL，混合后计时，1 min 后每隔10 s，缓慢倾斜试管一次，观察血清是否凝固，出现凝胶状固体时停止计时，记录复钙时间.实验数据以均数±标准差表示.

1.7.2 动态凝血时间(CT)实验 参照文献［13］，取内径为8 mm 的洁净玻璃试管，每管分别加入各物质，再加入0.025 mol/mL CaCl2溶液0.1 mL，摇匀后于各管内同时加入新鲜兔血0.5 mL，并设空白对照，轻摇，混匀，立即计时，在37 ℃的水浴箱中观察，每隔30 s 轻轻倾斜试管1 次，观察有无凝血.从加入兔血开始计时，到倾斜试管血块凝固于管底不流动时为止，即为凝血时间，每个重复实验6 次，取其平均值.实验数据以均数±标准差表示.

2 结果与分析

2.1 红外光谱分析

图1 为SCS、WPU 和多孔WPU/SCS 复合膜的红外光谱图.在谱线a 中，3 322 cm－1处为羟基和氨基的特征吸收峰;1 626 cm－1处为的特征峰;1 228 cm－1峰为硫酸酯中的非对称振动，804 cm－1处峰为C—O—S 的对称振动，这2个峰说明有—SO3存在. 在谱线b 中，2 273 cm－1处为—NCO的特征吸收峰，表明所制得的WPU 中有未反应的—NCO 存在. 3 326、1 710 及1 537 cm－1处的峰表明—NCO 与—OH 反应生成氨基甲酸酯基. 在谱线c 中，2 273 cm－1处的—NCO 的特征吸收峰消失，表明—NCO 参与反应;3 094 cm－1处为羟基和氨基的吸收峰变窄，并稍微位移，说明磺化的壳聚糖的羟基和氨基上有新的基团引入，同时也说明加入WPU破坏了SCS 分子内和分子间的氢键.与硫酸化壳聚糖相比，谱线c 中的1 694、1 541 及1 303 cm－1峰为酰胺的吸收峰，说明硫酸化壳聚糖的氨基上发生了N-乙酰化反应.

图1 SCS、WPU 和SCS/WPU 的红外光谱Figure 1 FTIR spectra of SCS，WPU and SCS/WPU

2.2 显微观察与扫描电镜观察

从图2 中可以看出:不同致孔剂质量百分含量下，WPU/SCS 复合膜的形貌发生了明显的变化. 多孔WPU/SCS 复合膜中，大部分孔洞结构均匀，孔径相差不大，光学显微镜测得其孔径分布在3～8 μm.随着致孔剂CaCO3(平均粒径为2.74 μm)质量百分含量的增加，单位面积内的孔洞增多. 但致孔剂过多会使其在溶剂中的分散性变差，所以致孔剂的使用量确定在12%左右即可.

图2 不同致孔剂含量下WPU/SCS 复合膜的显微观察Figure 2 Photos of WPU/SCS under different levels of porogen

图3 分别是致孔剂质量百分含量为0、6%、12%的WPU/SCS 复合膜的扫描电镜图，WPU/SCS复合膜表面比较光滑，当加入致孔剂后得到的WPU/SCS 复合膜具有多孔结构，且孔的大小主要集中在0.5～3 μm.

图3 不同致孔剂含量下WPU/SCS 复合膜的扫描电镜图Figure 3 Section of WPU/SCS under different levels of porogen

2.3 致孔剂含量对WPU/SCS 复合膜性质的影响

多孔WPU/SCS 复合膜的孔隙率和吸水率随致孔剂CaCO3(平均粒径为2.74 μm)使用量的增加而增大(图4).这是由于随着致孔剂添加量增加，反应产生的气体增多，所形成的微孔数量会增加. 同时，因为添加量的增加，致孔剂在成膜过程中形成的核数量增加，WPU/SCS 复合膜的吸水率增大. 但致孔剂过多会使其在溶剂中的分散性变差，所以致孔剂的使用量确定在12%左右即可.

图4 致孔剂CaCO3 使用量与WPU/SCS 复合膜的孔隙率和吸水率的关系Figure 4 The relationship of the contents of porogen CaCO3 on the porosity and water absorption of WPU/SCS

2.4 差示扫描量热分析(DSC)

图5 中a、b 分别为WPU 和WPU 接枝SCS 的DSC 曲线. WPU 和WPU 接枝SCS 都存在2个玻璃化温度，较低的为软段的玻璃化转变温度(Tg1)，较高的为硬段的玻璃化转变温度(Tg2)，这说明该聚合物是由硬、软段构成的，并且硬段和软段存在明显的微相分离. 曲线a 与曲线b 相比，聚合物的Tg1由－63.4 ℃升高到－59.8 ℃，Tg2由50.5 ℃升高到52.1 ℃，是因为接枝到WPU 的SCS 的硫酸酯基与软段形成氢键作用，使得链段运动受阻，导致软段玻璃化温度升高;在WPU 分子链上接枝硫酸化壳聚糖后，该分子骨架的刚性增大、柔韧度降低，分子链的自由运动受到限制，导致复合物材料的硬段玻璃化温度升高.

图5 WPU 和WPU/SCS 的差示扫描量热分析Figure 5 DSC curves of WPU and WPU/SCS

2.5 复钙时间(PRT)和凝血时间(CT)实验分析

复钙时间原理是:在已除去Ca2+的血浆中重新加入Ca2+，使其重新恢复凝血作用，如血浆中含有的内凝系统所需要的凝血因子减少，加钙后血浆凝固所需的时间(即复钙时间)则会延长.复钙时间实验是用于研究材料对凝血因子的激活情况. 体外动态凝血时间实验目的是检测内源性凝血因子被激活的程度，以此来观察材料对凝血时间的影响.表1 为各种材料的复钙时间和凝血时间测定结果.

表1 中实验测定结果显示，WPU/SCS 复合膜表现出的复钙时间比纯血浆和WPU 膜的均有明显延长，这是由于SCS 易溶于水，在WPU 膜表面接枝SCS，可以提高其亲水性，对凝血因子的激活有延缓作用，并可阻抗多种蛋白质和白细胞的粘附，显著地延缓离体血液中凝血因子和内源凝血系统的激活，因此在WPU 表面接枝SCS 的复合膜的凝固时间比纯WPU 膜的延长了50%左右.而多孔WPU/SCS 复合膜存在孔结构，接触面积增大，所以多孔WPU/SCS 复合膜的复钙时间和凝血时间都比无孔的WPU/SCS 复合膜的要长.说明多孔WPU/SCS 复合膜具有较好的血液相容性.

表1 各种材料的复钙时间和凝血时间测定结果Table 1 Results of recalcification time and dynamic blood-clotting of various materials

3 结论

采用己二异氰酸酯三聚体(HT)等合成了水性聚氨酯(WPU)，以CaCO3作为致孔剂，并与硫酸化壳聚糖(SCS)接枝，制得多孔WPU/SCS 复合膜. 通过光学显微镜观察、复钙时间和动态凝血时间测试对复合膜的结构形态和血液相容性进行了表征. 结果表明，多孔WPU/SCS 复合膜中，大部分孔洞结构均匀，其孔径分布在3～8 μm，致孔剂CaCO3使用量为12%时，孔隙率为68.3%，吸水率达112.5%，多孔WPU/SCS 复合膜具有较好的血液相容性，是一种理想的生物医用材料.

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