百蕊草药材高效液相特征图谱的研究

王雨艨，张亚中，吴德玲

(1.安徽中医药大学，安徽合肥 230031;2.安徽省毫州市食品药品检验所，安徽毫州 236800;3.安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051)

百蕊草(Thesium Chinense Turcz)别名有百乳草、珍珠草、白风草、一棵松、细须草、地石榴等，是檀香科百蕊草属多种植物药材的统称。百蕊草是百蕊草或者其变种长梗百蕊草的干燥全草［1－5］，始载于《图经本草》，性寒而平缓，味微苦涩，具清热解毒、通顺气脉、补肾涩精及调气功效，有“植物抗生素”美称。百蕊草常用于治疗急性乳腺炎、急性扁桃体炎、上呼吸道感染、遗精、肺炎、咽炎、淋证、肺脓肿、淋巴结结核、乳蛾、乳痈、疔肿、黄疸以及肾虚腰痛、肾虚头晕、各种感染等疾病，且无毒副作用［6］。《中国药典》1977年版曾把百蕊草药材收录到其中，但仅从药材性状上进行控制，在使用过程中往往是原药材或粗提入药有效成分含量低，由于没有一个统一的系统的质量标准，缺乏相应的评价体系，从而影响了这一传统中草药治疗作用的发挥。因此，笔者选择百蕊草素I作为指标性成分并对其特征图谱进行研究，进而为百蕊草药材质量标准的制定提供科学依据［7－8］。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ACQUITY UPLC高效液相色谱仪:沃特斯公司;色谱工作站:Masslynx工作站:沃特斯公司 ;色谱柱:Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);FA314 型电子天平(上海海康电子仪器厂)。指纹图分析软件:中药色谱指纹图谱相似度评价系统。

1.2 试剂与试药 乙腈为色谱试剂，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。对照品:百蕊草素Ⅰ(购自成都曼思特生物科技有限公司，批号:MUST－13112210含量为99.45%)。百蕊草药材:共收集安徽、河南、湖北三省10批百蕊草药材，均是以白茅为寄主，野生的百蕊草，并对其进行了鉴定，均为檀香科植物百蕊草(Thesium Chinense Turcz.)。见表1。

表1 样品信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)，以乙腈(A)—0.2%甲酸(B)为流动相，按表(2)进行梯度洗脱，检测波长为265 nm，柱温35℃，流速 0.4 mL·min－1，进样体积 2.0 μL，见表2。

表2 色谱条件与系统适用性

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取百蕊草素Ⅰ对照品11.81 mg置20 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀释定容至刻度，即可。

2.2.2 供试品溶液制备 取百蕊草药材粉末(过三号筛)约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加60%甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率200 W，频率为40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液，即得。分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各2 μL，注入液相色谱仪［9－10］。

2.3 方法学研究

2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，分别按“2.1”项下的方法测定供试品中各色谱峰的保留时间，其相对标准偏差RSD均小于1.0%，实验表明:本法重现性良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批样品6份，分别按2.1项下的方法测定供试品中各色谱峰的保留时间，其RSD均小于1.0%，实验表明:本法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取新制备的供试品溶液，立即注入液相色谱仪，并每隔一定时间测定一次峰面积，直至45 h。其相对保留时间的相对标准偏差RSD均小于1%，峰面积在45 h内的RSD均小于1.0%。实验表明:本法重复性良好。

2.4 样品测量结果 见表3。

表3 10批样品色谱峰相对保留时间(min)

2.5 特征图谱的建立 取收集到的10批百蕊药材，分别按上述供试品溶液制备方法制成供试品溶液，再取百蕊草素Ⅰ对照品溶液，注入液相色谱仪测定，10批百蕊草药材测定所得色谱图，输入中药指纹图谱相似度评价系统A中，分析处理，共12个共有峰，选择其中4个作为特征峰。与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±8%之内。相对保留时间规定值为:0.52(峰 1)、1.00(峰 S)、1.18(峰2)、2.09(峰3)，见图1、2。

3 讨论

3.1 波长的选择 文献报道其主要化学成分为黄酮类化合物，因此现有的百蕊草质量标准以测定百蕊草总黄酮的含量来控制药材以及制剂的内在质量。通过文献研究以及我们的实验表明，黄酮类类化合物有两个吸收峰，分别位于265 nm以及347 nm附件，因此吸收波长的选择上，265 nm和347 nm均可，考虑到265 nm吸光度更强，取265 nm作为指纹图的采集波长(图3)。

3.2 流动相的选择 文献记载一般采用甲醇—磷酸系统，考虑到特征图谱HPLC分离系统兼容LCMS特征图谱辅助定性分析，极性流动相部分，采用了甲酸水系统。

3.3 样品处理方法的选择 首先对提取溶剂的种类(100%甲醇、60%甲醇30%甲醇)，其次是提取方法(超声提取和加热回流)，最后是提取时间(15、30、45 min)对色谱图的影响。最后确定最佳样品处理方法为取百蕊草药材粉末(过三号筛)约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加60%甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率200 W，频率为40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液，即得。

4 结论

本文以百蕊草药材为研究对象，以百蕊草素I为对照品作为百蕊草中测定总黄酮的含量指标，对安徽、河南和湖北等三个产地10批的百蕊草药材进行研究，建立了百蕊草药材的HPLC特征图谱，为百蕊草药材质量控制提供了有效的分析方法。同时对其主要有效成分百蕊草素Ⅰ进行了含量测定，为中药制剂的质量控制提供了良好的分析方法。为未来合理、有效地利用百蕊草资源提供了科学依据，同时也可用于制药企业以及药品监管部门对百蕊草药材的质量控制及评价。

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